折叠色谱对还原胍变性牛胰岛素折叠特性地研究.pdfVIP

折叠色谱对还原肌变性牛胰岛素折叠特性的研究 白 泉 孔 宇 耿信笃 (西北大学现代分离科学研究所，现代分离科学陕西省重点实验室。西安710069) 在生物工程中，人们用重组DNA技术已成功表达了4000多种蛋白药物，但真正用于临床的却 只有20余种。这主要是因为90%的产品是用大肠杆菌(E.co仍表达的。而在E.Coli中表达的这些 蛋白药物由于疏水性很强，可形成难溶于水的包含体，只有加入高浓度的变性剂才能溶解。当除去 变性环境后，一部分蛋白质可以自动折盛成具有生物活性的天然结构，称之为蛋白质的复性。据统 计95%的蛋白中含有二硫键，而对于这些含有二硫键的蛋白药物，由于表达过程中形成错误的二硫 键配对，藉向其包含体提取液中加入还原剂，如声疏基乙醇、二硫苏糖醉 (DTT)等，先将错误配 对的二硫键打开。再进行折叠复性。所以，如何提高变性蛋白在折盛过程中二硫键的正确对接率， 对蛋白药物的纯度和产率的提高及生物工程技术的发展具有非常重要的意义，这亦是分子生物学中 的前沿课题。 对于还原变性的蛋白的复性.通常在复性溶液中加入氧化剂.如氧化型谷魏甘fft(GSSG)，进 行稀释或透析，使二硫键在氧化条件下正确对接[[11。还有人加入二硫键异构酶121和分子伴侣I;)催化二 硫键的正确配对，从而提高蛋白的复性效率。但这些方法条件苛刻，不易控制，又易引入杂蛋白。 近来人们利用液相色谱进行变性蛋白折叠与复性的研究。Batas等141将氧化型和还原型谷肤甘肤按 一定比例加入到流动相中，用体积排阻色谱(SEC)研究还原变性的溶菌酶和碳酸醉酶的折亚与复性， 得到较好的效果。英国剑桥大学的一个研究小组将分子伴侣键合到色谱固定相上，利用分子伴侣可 协助蛋白复性的特点，将不能在溶液中复性的蛋白质利用色谱法得到了很好的复性效果，并称之为 折叠色谱131。作者之一早在10年前就首创了用疏水相互作用色谱(HPHIC)对变性蛋白进行复性，并 提出了变性蛋白 “人工折叠”的概念，其复性机理与分子伴侣协助蛋白折叠极为相似I1。本文拟以 分子质量较小、结构简单明确的标准牛胰岛素 (insulin)为模型蛋白，用HPHIC和SEC对还原肌 变性的牛胰岛素的折处规律进行比较研究。 1 结果与讨论 1.1HPHIC对还原服变性牛胰岛泉的分离 将还原变性肌变和天然牛胰岛素用HPHIC进行分离和复性色〔谱图未示)。结果表明，还原孤变 性牛胰岛素经HPHIC分离可得到3个色谱峰。其中一个色谱峰与天然牛胰岛素相同。但峰形变宽， 其余两个色谱峰为胰岛素的折叠中间体。表明还原肌变性的胰岛素用HPHIC只能部分复性，且复 1性效率非常低。 1.2氛化型流动相对还原服变性牛胰岛紊复性的影响 将少量的氧化型谷胧昔肤加入到流动相中((A液:3.Omol/L(NH4)2SO4)+0.050mol/LKH2PO4+ 50mg/LGSSG,pH7.0;B液:0.050mol/LKH2PO4+50mg/LGSSG,pH7.0)，研究氧化型流动相对还 原孤变性牛胰岛素复性的影响。图1中的la是还原脏变性牛胰岛素 .采用氧化型流动相时在HPHIC 上的色谱分离图，图lb为天然胰岛素。从图1可看出，还原肌变性牛腆岛素经HPHIC复性后，如 图la所示可得到1个色谱峰，它的峰形、保留时间与天然腆岛素(图lb)相同，这表明加入氧化型 谷眺昔肤后，不仅提高了胰岛素二硫键的对接率，而且提高了复性效率。但是与天然胰岛素色谱图 国家自然科学基金(No,陕西省教委专项基金(No.99JK101),教育部青年骨干教师基金 联系人:白泉，电话:029-8302808 (lb)比较，还原肌变牛胰岛素色谱峰的峰面积为天然胰岛素的66%，这说明还原呱变性的胰岛素在 氧化剂存在下，用HPHIC可对其大部分复性，复性效果要比采用非氧化型流动相好得多。 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 1/min tlmin 图I氟化型流动相对日p川C分离还原肌变和 图2 SEC对还原胆变和夭然牛胰岛紊的色谱图 天然肢岛亲分离效果的影响 a.K变，b.天然，胰岛素进样f为150pg. a.脏变，b.