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166 果蔬加工技术与产业化国际研讨会论文集 提高苹果基因转化效率的研究 “ 刘庆忠 ‘赵红军 ‘ FreddiHammerschl时 t山东省果树研究所 泰安 271000;2美国农业部Beltsville 农业研究所中心果树实验室，Beltsville,MD20705,USA) 摘 要 本文采用农杆菌强株系EHA105哪sM -inum)和EHA101(两9OUS)研究了 l，皇家厦啦”苹果 (MalesdanesticaBokh)的白化茎段外植体的p一荀萄枪醛酸阵 (GUS)墓 因的瞬时、德定表达水平和转蕃因植株的再生。采用根癌农杆菌ERA105证明在培养墓生长 素 (IBA,NAA)存在的条件下，外植体的GUS基因的瞬时表达水平提高了3-4倍，而共培 养两周后德定表达水平提高两倍以上，产生9.8个。US愈伤组织表达区域。采用根痛农杆菌 EHAIO1，在生长素存在的条件下2%外植体获得了转墓因植株。PCR扩增、SculhemBlotDNA 杂交和组织化学染色分析证明GUS签因已整合到苹果的染色体上，并得以表达。 关键词 苹果 GUS基因 生长素 农杆菌 转基因植株 苹果是重要的落叶果树树种。由于其童期长，自交不亲合，杂合程度高。易于离体再 生等原因，采用基因转移技术获得转基因植株已逐渐成为苹果育种的重要手段。尽管采用 叶片外植体已成功地获得了转基因植株，但转化效率低，获得转基因植株比率多在0.1%- 0.5%rt[o高的再生效率和低的转基因效率，主要是由于缺乏对影响转化因素的彻底认识。 有几篇报道[2-6〕指出农杆菌株系、材料预培养、乙酞丁香酮、渗透保护剂磷酸甜菜碱、培 养基的成分、外植体的发育阶段、刺伤等都影响转化效率，但要建立高效的苹果农杆菌介 导转化体系仍有许多因素需要探讨。我们研究的目标是通过基因转移技术培养抗病的皇家 嘎啦新品系。我们已报道过白化茎段外植体促进苹果的离体再生和基因转化[[71，本文将报 道生长素影响转化效率并成功地获得转基因植株。 1材料与方法 1.1桂物材并 皇“家吸啦”(RoyalGala)苹果白化茎段外植体取自离体生长的新梢顶部第一节间。 离体新梢保持在增殖培养基上，每隔4周取lcm新梢作为外植体转移一次。增殖培养基由 ms无机盐附加100mg/L肌醇、0.5mg/L盐酸硫胺素、1.Onmg/L6一节基嚓吟、O.lmg/L OM 丁酸、0.5mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂组成，pH值为5.6,培养室的温度 为259C，光照强度p40.1 M-2.s-I，光周期为16小时光照，8小时黑暗。新梢白化处理 则是在正常条件下生长2周后接着进行2周的黑暗处理i7] 奄农业部科技司、山东省农业 “三。“工程、山东省人事厅、山东省农业科学院资肋项目。 提高苹果基因转化效率的研究 167 1.2农杆菌林系 农杆菌选用含有双元载体的根癌农杆菌 (Agrobacteriumtunrefaciens)EHA101。双元载 体携带一个嵌合的NosNPT亚基因和一个嵌合CaMV35SGUSA基因。根癌农杆菌ERM05 含有双元载体闪5SGUSint,载体p35SGUSint由含有植物内含子 (Intron)的GUSA的嵌合 基因组成，使GUSA仅能在植物组织表达，而不能在农杆菌中表达C2;。农杆菌的基本培养 基为、FB (牛肉陈5.飞/L,琼脂牛提取物5.0g/L,酵母提取物l.Og/L,蔗糖5.0g/L，琼 脂1.5%,pli7.2)o 1.3共培养与转基因桂株再生 农杆菌在不含琼脂的培养基 (2OOtpm,28℃)生长一昼夜，离心提取细菌，用凡大 量元素、1S微量元素培养基附加20F4n乙酞丁香酮、ltng/LTDZ,0.5NAA的液体培养基 悬浮，稀释到光密度为2X1沪cfu/ml。将切割好的外植体于农杆菌液中浸蘸，取出后转移 到与悬浮农杆菌的相同的液体培养基上共培养48小时，然后转移到残附加lmg/LTDZ, 0.5mg/LNAA,100mg/L头抱唆吩、100mg/L般节青霉素、50mg/L卡那霉索，连续选择 培养6周，每隔2周更换一次新鲜培养基。 1.4GUS组织化学染色分析 获得的抗卡那霉素新梢的GUSA基因的表达