HPLC分离MALDI-TOF-MS鉴定合成多肽地研究.pdfVIP

第2l卷 质 谱 学 报 、b1．21 JOURNAL 第3,4期 OFCHINESEMASS SPECTROMETRYSOCIETY NO．3．4 多肽的研究丰 熊少祥赵睿余晓赵莹欣辛斌王光辉刘国诠 (北京质谱中心中国科学院化学研究所分子科学中心北京100080) 固相肽合成技术是现代蛋白质化学的一项关键技术，对现代分子生物学和基因工 程研究具有重大影响和意义川。组分单一的多肽可用于蛋白质结构、信号传递、药物作 用、免疫反应等研究领域。但是，肽合成过程中往往由于各种因素的影响，难以得到 纯度合格的多肽产品。因此，合成多肽的分离提纯和结构鉴定是当前多肽化学研究中 不可缺少的部分。 我们建立了利用高效液相色谱(HPLC)除盐、分离、提纯、浓缩微量台成多肽． 基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI．TOF)质谱分析鉴定的系统和方法。考察了 不同基质、激光强度、延时引出时间和电压等因素对质谱分析结果的影响。具有目标 肽质谱图易于识别，样品消耗量少，检测灵敏度高等显著优点。已用于近百个合成多 肽样品的分析。 1实验部分 合成多肽样品按通用的FMOC固相肽合成方法口l制备，使用前配制成合适浓度的 样品溶液。 Nucleosil 77251进样阀、Phenomenex I．D．)、 测器、Rheodyne C18色谱柱(250x4．6mm WDL-95型色谱工作站构成HPLC分离系统。样品进样后．以1．0 mL／min的流速，0～ 30分钟内．含0．1％_氟乙酸的5％乙腈水溶液至含0．1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液 线性梯度淋洗。UV220nm检测的色谱条件，进行分离监测。色谱峰流出液收集于离心 管．留特随后的质谱分析。 质谱所用仪器为BrokerDaltonics公司BIFLEX III型MALDI-TOF质谱仪．氮激 光器，激光波长337nm，采用延时引出(Delayed 作方式，加速电压19．5 kV,反射电压20kV，延时引出电压14．5～16．5 kV．延时时间 为50～200 ns，正离子检测。将色谱峰收集液与适量的基质溶液混合后，取约l微升 溶液．滴加在样品靶上，待溶剂挥发，样品结晶后，送入质谱仪．进行质谱分析，累 ’中国科学院九五重大项目资助课题 ． B4 第3,4期HPLC分离MALDl．TOF．MS鉴定合成多肚的研究 加10～50次单次扫描信号得到质谱图。 2结果与讨论 图l所示为一合成多肽样品的HPLC分离色谱图。在所用的分离条件下，分离成 两大--d,共5个色谱峰．此5个色谱峰的具体成份通过MALDI．TOF质谱鉴定。含量 高的色谱峰收集液可以直接与基质溶液混合，制样后测定。而含量低的色谱峰收集液 则用氮气吹干液体后，取若干微升基质溶液将样品从容器壁上洗脱并制样分析。 纵 11川‘．4‘ aj．㈧■‘ Jn■n 图1某合成多肚样品的高效液相色谱图 图2某分离提纯的台成多肚样品的^IALDI-TOF图 MALDI-TOF质谱条件优化实验结果表明：不同基质、检测模式、激光强度、延时 引出时间和电压等仪器操作条件对所得质谱有很大的影响。在合适的实验条件下，可 以得到分辨率高、同位紊峰之问基线分离的多肽样品的质谱图。图2所示的质谱图． 代表了合成多肽MALD[-TOF质谱的一般规律。对应