RNA操作技术.docVIP

RNA and the Cellular Biochemistry Why Study RNA? What is RNA? Assembly of Polynucleotides 5 Types of RNA Messenger RNA mRNA Stability, Transport, and Turnover RNA的种类及特点 总RNA包括mRNA,rRNA,tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞中，80%-85%为rRNA 、15%-20%为tRNA及sRNA，mRNA约占总RNA的1%-5%。 rRNA电泳后的三条特征性条28S、18S和5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。 mRNA呈单链状，易受核酸酶的攻击，操作时必须保证实验环境、所用器皿及溶液均无RNA酶的污染。 裂解缓冲液（VRC），NP-40，搅拌，离心分离RNA的策略概述纯化 原理： Trizol试剂使用最广泛的抽提RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸瓜组成可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来并使核糖体蛋白与RNA分离，还能保证RNA的完整性。 提取步骤 1.用液氮研磨材料，匀浆加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。 2.加入氯仿抽提，离心，分离水相和无机相，收集含RNA的水相。 3.用异丙醇沉淀，漂洗溶解。 1.2.2普通离心柱法 原理: 含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱时，硅胶模对RNA的吸附，使RNA与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶模上直接洗脱。 1.2.3氧化锂法 基本原理：采用高浓度尿素变性蛋白，并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA。本法特别适用于从大量样品中提取少量组织RNA，并具有快速简捷的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高、小RNA片段丢失的缺陷。 1.3RNA浓度和纯度的测定 1.31通过测定其OD260和OD280来判断。 OD260为1时相当于浓度为4㎎/ml。 如果OD260/ OD280在1.8-2.0，表示所提取的RNA纯度较好。 如果OD260/ OD280明显低于1.8，表示样品中可能有蛋白质或酚污染。 1.3.2通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 为什么研究RNA? RNA是什么? 多核苷酸的装配 RNA的种类 转录和中心法则 研究转录的重要动植物模型 启动子和调控元件 基因和基因组的组织影响转录 RNA聚合酶和转录产物 信使RNA 典型的mRNA分子的拓扑学 5’帽 引导序列 编码区 尾随序列 多聚A尾 细胞器mRNA mRNA的稳定性、转运和转归 双顺反子mRNA 原核mRNA mRNA的序列和结构影响翻译 基因调控的水平 来自单基因座的mRNA的可变剪接 反式剪接:mRNA的修复 小RNA综观 微小RNA对基因表达的调控 参考文献 2 分离RNA的策略 概述 纯化RNA过程中的目标 裂解缓冲液配方 温和的裂解缓冲液 方案:用低渗裂解分离胞质RNA 离液性裂解缓冲液 用含胍的缓冲液分离RNA 胍-酸-酚抽提技术 方案:胍-酸-酚抽提 密度梯度离心 氯化铯 方案:氯化铯梯度 三氟乙酸铯 方案:三氟乙酸铯梯度 同时分离RNA和DNA 方案:同时分离RNA和DNA 说说试剂盒 硅胶的技术 用硅胶柱分离胞质RNA 亲和介质 其他方法 方案:用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA 方案:分离原核RNA 方案:分离酵母RNA 提纯的RNA的短期和长期保存 参考文献 3 关于组织的真相 概述 组织培养物还是组织? 细胞培养的优点 组织样品的优点 匀浆法 用Polytron捣碎 用Dounce匀浆器匀浆 BeadBeaterTM技术 各种器官和组织的RNA分离的策略 新鲜组织 冻存组织 固定的组织 方案:分离组织RNA的LiCl-尿素法 方案:从富含类脂样品分离RNA 与聚核糖体结合的mRNA的提纯 方案:聚核糖体mRNA的分离 在野外收集样品 RNA“清洗”法 从组织分离RNA的困难解决 参考文献 4 走向绿色:植物RNA及其分子生物学 概述 RNA的分离和植物的怪异点 植物细胞产生的RNA的种类 方案:从叶中分离RNA 方案:从树皮中分离RNA 方案:从果实中分离RNA 从其他植物组织分离RNA的策略 从植物组织分离RNA的困难解决 参考文献和建议阅读 5 带PolyA尾的RNA的分离 概述 加PolyA尾 利用Poly(A)时的注意事项 例1 例2 选择带PolyA尾的分子 用于提纯Poly(A)+的磁珠技术 Oligo(dT)