第五讲 现代生物技术.ppt.Convertor.docVIP

第五讲 现代生物技术 第一部分、基因工程 遗传信息的奥秘 DNA由4种核苷酸组成(ATCG) 每3个核苷酸编码一个氨基酸 基因就是DNA分子上含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 （一） 基因工程的概念 克隆（Clone）：是无性繁殖的译音 基因工程：是指在体外将外源DNA分子经切割和连接，插入至病毒、质粒或其他载体分子中，形成重组DNA分子，导入到受体细胞中，使外源基因在受体细胞中表达的过程。 常用的宿主如大肠杆菌、酵母、动物(包括昆虫)和植物细胞。 将目的基因转入微生物则成为工程菌；将目的基因转化于植物或动物则成为转基因动植物。 理论上的三大发现 ★ 证明遗传物质是DNA ★ DNA分子双螺旋结构及半保留复制 ★ 中心法则及遗传密码的破译 技术上的三大发明 ☆ 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 ☆ 基因工程的载体 ☆ 逆转录酶的发现 基因工程操作的工具酶 根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为三大类： 1.限制性核酸内切酶（内切酶）：将DNA分子在特定部位切开。 2.DNA连接酶：将切割位点相同的两条链连接起来。 3.DNA聚合酶：以母链DNA为模板，在引物的指导下，按母链核苷 酸序列，将游离的核苷酸结合到相应的位置而形成互补的双链DNA。 限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建 基因工程的载体 基因工程的载体必须具备以下基本要求： 1.在寄主细胞中能够独立复制； 2.易从寄主细胞中分离纯化； 3.有一段不影响自身扩增的非必需区域，使得插在其中的外源基因可以正常复制和扩增。 基因工程的载体主要有六类： 1. 质粒载体：能自主复制；具有若干限制性内切酶的单一识别位点；有选择标记；较小的分子量和较高的拷贝数。 2. 噬菌体载 3. 柯斯质粒载体 4. YAC载体 5. BAC载体 6. 病毒载体：SV40通过感染方式将DNA送入哺乳动物细胞中。 （二）基因工程的基本内容（重组DNA技术） 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆（molecular cloning） 基因工程的主要步骤： 1.载体和目的基因的分离 2.载体和目的基因的体外重组 3.重组DNA转化受体 4.重组DNA的筛选和鉴定 5.克隆基因的表达 (1) 基因组水平的鉴定 (2) 转录水平的鉴定 常用的方法 Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交） RT-PCR 检测 mRNA cDNA PCR （3）翻译水平的鉴定 为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。 主要方法：Western杂交 免疫检测 （4）个体水平的鉴定 1.根据重组体的表型进行筛选 2.根据标志互补进行筛选 转基因成功的条件： （1）外源基因的单拷贝插入和被插入受体基因组的被扰乱的“综合效应”； （2）转化后的受体能够长成可遗传的生物个体。 （三）基因导入的方法 植物材料：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、电激法等 动物材料：脂质体转化法、显微注射、逆转录病毒、精子载体、电穿孔、磷酸钙介导法等。 细菌材料：电激转化或转导 （四）基因工程的应用 1、基因工程药物 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质-肽类药物。 基因工程药物（Genetic engineering drugs）：系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 基因工程药物的种类 基因工程DNA重组药物主要成分为多肽或蛋白质类，大致可分为以下三大类： 1. 激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子（human somatotin )，人胰岛素（human insulin)，人生长激素（human growth hormone） 2. 细胞因子类药物：人干扰素（human interferons