蛋白质组学及其进展.pptVIP

蛋白质组学及其研究进展 主讲人:王海波 . 蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由Ｏ’Ｆarrell，s于1975年首次建立并成功地分离约1000个Ｅ ｃｏｌｉ蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化 。双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿ｐＨ梯度分离至各自的等电点,随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(ｓｐｏｔ) . 样品制备和溶解同样事关2- ＤＥ的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用 对ＩＥＦ样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质 。理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理 。低丰度蛋白在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的“冰山之尖”,故分高低丰度蛋白是一种挑战亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15ｍｇ级的标准) 、应用敏感性检测,可以提高其敏感性 如一种多肽免疫2 -ＤＥ印迹是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白的分离是另一难点， 由于碱性ｐＨ范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流的产生,对pI超过10的碱性蛋白,通过产生0～10%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之， 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性。 . 2 -ＤＥ面临的挑战是高分辨率和重复性 ：高分辨率确保蛋白最大程度的分离,高重复性允许进行凝胶间配比.对2-ＤＥ而言,有3种方法分离蛋白: 1)ISO-DALT以Ｏ’Farrell,s技术为基础 第一向应用载体两性电解质,在管胶内建立ｐＨ梯度 随着聚焦时间的延长,ｐＨ梯度不稳,易产生阴极漂.2)NEPHＧＥ用于分离碱性蛋白(ｐＨ7.0) 如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失 因此,在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成,但很难控制 3)IPG-DALT发展于80年代早期.由于固相ｐＨ梯度的出现解决了ｐＨ梯度不稳的问题 .ＩＰＧ通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的ｐＨ梯度,克服了ＩＥＦ的缺点,从而达到高度的重复性 目前可以精确制作线性、渐进性和Ｓ型曲线,范围或宽或窄的ｐＨ梯度. 新的酸性ｐＨ3-5或碱性ｐＨ6-11的IPG凝胶梯度联合商品化的Ｐｈ4-7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群从而有效分离. . 分离后的斑点检测(ｓｐｏｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎ)亦很重要 .所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外,还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前,没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和ＰＩ及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2- DＥ的流行方法,可检测少到2～5ｎｇ的蛋白,因此较考马斯亮蓝Ｒ- 250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,一些有机染料不适于ＰＶＤＦ膜 放射性标记不依赖其代谢的活性,并仅适于对合成的蛋白质检测.另有一种改良的2- ＤＥ(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2 -ＤＥ的比较,可在纳克级进行检测. * * . . 蛋白质组学及其研究进展 蛋白质组学的含义 蛋白质组学研究的内容 蛋白质组学研究的手段 蛋白质组信息学 差异蛋白质组学 蛋白质组研究意义及前景 . 讲授内容 一、蛋白质组学及其研究进展（晏本菊） 二、核酶、抗体酶（陈惠） 三、蛋白质定向进化—DNA Shuffling 技术（陈惠） 四、细胞信号传导、肽核酸（杨婉身） . 生物化学专题 主讲教师 杨婉身 晏本菊 陈惠 . 蛋白质组学的含义 蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者 Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出,指的是由一个基因组geneome或一个细胞、组织表达的所有protein。蛋白质组学(proteomics)是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。 同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能,是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁。 . 蛋白质组学研究的内容 蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究 蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其