井冈霉素裂解微生物的筛选的研究初报.pdfVIP

井冈霉素裂解微生物的筛选研究初报 陈振明 陈小龙 胡忠策 王远山 郑裕国 沈寅初 (浙江工业大学生物工程研究所，杭州310014) 摘要 从土坡中筛选到多个橄生物菌株，可有效得裂解井冈霉素产生对淀粉阵活有抑制作用的物质。 对其中抑制效果校禅的A6110菌株发醉液进行薄层层析和质诱分析初步表明，该蔺林发踌液中含有井 冈按 。 姜.询 井冈奚青 熨解 井冈胺 筛选 井冈霉素是我国自主发现并独立开发成功的第一个抗生素。自70年代开始使用至今已有30 多年，但它仍是目前最为有效，应用面积最广的农用抗生素之一。井冈霉素因而成为我国产量 最大的抗生素，同时，我国也成了世界上最大的井冈霉素生产国。但与生产规模的扩大相伴随 出现的一个问题是销售价格的降低，从而直接导致生产企业利润的下降，减少经济效益。要使 井冈霉素产业继续发展，必须对井冈裸素进行深加工。 早期研究发现’「〕，土壤细菌对井冈霉素A降解的过程中可产生井冈胺。井冈胺是一种假氨 基糖物质，对糖昔酶等水解酶有较强的抑制作用，能用于预防与治疗高血糖、糖尿病、肥胖症 等疾病;同时升冈胺又是一种化工原料和医药中间体，可以合成很多化工产品与药品，如解脂 素、阿卡波糖、抑淀粉紊等。因此，如能从土城中筛选到可把井冈霉素高效裂解为井冈胺的微 生物，则有望大幅提高井冈霉素的附加值。本研究正是基于这一思路而开展的。 1材料与方法 .11徽生物菌株的筛选 1.1.1筛选过程:土样~初筛培养基划线分离~复筛培养基摇瓶培养 ‘发醉液的淀粉酶活抑制 能力测试 1..12 土样:采自全国各地稻田，麦地和果园土城。 1.1.3 培养基 初筛培养基:葡萄糖2%,酵母粉 1.5%,K,HP0,0.7%,KHZPO,0.390,MgSO,7H20 0.02%，NaCI0.5%，琼脂3% 复筛培养墓:葡萄糖1%，井冈霉素1%, (NH,),SO,1%,凡HP040.7%,KH,P040.3%, M爵仪7H,00.01%，pH7.1 1.1.4 淀粉酶活抑制能力的测定 1.1.4.1试剂 淀粉酶液由本实验室制备，用禅为6.9的20mm的磷酸缓冲液 (含IOmMNaCI)配制。 底物:用蒸馏水配制成1.0%的可溶性淀粉溶液 DNS溶液:1g3,5一二硝基水杨酸加人20m12NNaOH溶液中溶解，再加人30g四水酒石酸 钾钠并溶解，最后用蒸馏水定容至100MLo 1.1.4.2 实验过程 O.5.L的酶液与0.3mL的复筛培养基发酵液在25℃下水浴5min，加人1mL的底物，在3790 F水浴酶解反应3mi。后，迅速加人DNS5.OmL，沸水浴3min,测得OD，值为Ta 以去离子水替代样品进行对照试验，测得OD、值为Bo 以pH为6.9的20mM的磷酸缓冲液 (含lOmMNaCI)替代酶液，以去离子水替代样品进行试 171 验 测得OD*值为Co 样品对淀粉酶的抑制率二 (T一C)/(B一C)-100% 2 l 井冈霉素降解产物的捉取、检浏 1.2.1 大孔树脂的预处理 树脂由漂莱特中国有限公司提供，用 1.0mol/LHCl浸泡树脂2一3hr，用去离子水洗至中性， 恐1.0mol/LN姚 ·玛。洗至pH8.0一9.0. 井冈霉素降解产物的提取 发酵液经10000rpm离心15min，取发酵上清液50mL，上柱，先用去离子水洗至流出来的液 体为无色，再用1.0mol/LNH,氏。进行洗脱，收集洗脱液100ML，将收集的洗脱液进行真空浓 缩至lOmL，得到粗提液，用于薄层分析。 1.2.3 薄层层析 展开液:正丙醉:乙酸:水为4:1:l(v/v)的混合液。 显色剂:布三酮溶液。 GF254硅胶板，青岛海洋化工厂生产。 取5pL井冈禅素粗提液进行点样，将点样后的硅胶板放人层析缸中进行展开，展开结束后， 先用风机把硅胶板吹干，均匀喷洒显色剂，于105℃进行显色反应5min,测量显色斑点的直径， 观察斑点的颜色。用本所自制的井冈胺和井冈霉胺标准品进行对照实验。 2 结果与讨论 2.1橄生物菌林的师选 利用初筛培养基从25份土样中共分离到近300株徽生物菌株。 用复筛培养基分