3 PCR-PFLP.ppt

实验结束后整理实验台, 值日生值日! 思考题： 1、基因组DNA的电泳结果很好，为什么做不出PCR结果？ 2、酶切DNA时为什么有时切不开？ * 整体实验时间安排： 简单介绍PCR-PFLP的相关知识（～5min) （1：30 ～1：35） 让同学在PCR产物中加入酶开始酶切反应 ( 学生操作25min+酶切反应40min )，在酶切反应期间详细讲解今天的理论知识第一二部分内容 （1：35 ～2：40） 酶切之后电泳,( 学生操作30min+酶切反应40min )，电泳期间讲解第三部分内容（2：40 ～3：50） 其余时间为学生答疑时间 （3：50 ～4：30） * 利用酶切时间讲解以下实验内容 1、 PCR-PFLP的原理 2、介绍限制性核酸内切酶 3、酶切软件使用 * 限制性内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解酶，在基因组或cDNA顺序中含有许多个限制性内切酶的识别位点，因此可以选择一种或几种限制性内切酶切割DNA，从而产生具有特定末端的长度不同的DNA片段 。 限制性内切酶是细菌用于降解病毒以防止病毒破坏细菌的一种自卫措施，因此内切酶对其来源的细菌基因组中特定酶切位点不起作用。因为在这些酶切位点顺序上细菌已进行了甲基化修饰。 * 限制性内切酶分三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ 和Ⅲ型同时具有限制和修饰两种功能，而且Ⅰ 型没有固定的切割位点，随机切割DNA而产生非专一性切口，所以在分子克隆中用处不大，Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性，因此成为分子生物学的工具酶。Ⅱ型酶识别4-6个碱基的回文顺序，在特定位点切割双链DNA，通常产生三种不同的切口，5‘ 突出的粘性末端、3’ 端突出的粘末端和平齐末端。 * * 此为“分析服务”页面 * 此为“限制性酶切分析”页面 * 此处为“提交样本”的位置 * 酶切分析结果 * 电泳时间介绍PCR-RFLP实验应用。 * * * 将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的基因分型技术之一。 当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳，将长度不等的DNA片段分离开，而显示出其长度多态性（片段的大小）。 * 实验三、PCR-RFLP分析 1、基因组DNA提取 （已完成） 2、以基因组DNA为模板PCR扩增特定基因 （GAPDH基因的PCR，已完成） 3、用内切酶对PCR产物进行消化 4、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳和结果分析 实验内容： 第一部分、Restriction enzymes 第二部分、 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳 第三部分、PCR-RFLP原理 第四部分、琼脂糖凝胶电泳的结果分析 实验内容： PCR产物的酶切消化 1、PCR产物 17μl 2、10×Buffer M 2μl 3、HindⅢ 1μl 总体积 20μl 混匀 ，37℃ 保温 40min ? 用限制性核酸内切酶将DNA 消化 ? Hind III 限制性酶切位点是A AGCTT 第一部分、Restriction enzymes 一、限制性核酸内切酶 二、酶切体系 三、酶切软件的使用 Identified in the late 1960s Key discovery which allowed the DNA cloning to become a reality Highly specific Commercially available 【主要内容] DNA 1、 Restriction endonuclease Bacterial enzymes :a natural defense mechanism of bacteria to against the introduction of foreign DNA into the cell Restric