产甘油假丝酵母酸性磷酸酯酶突变株的选育和其性质研究.pdfVIP

第=届金皿发群工程学术l寸沧会沦文寨】998 产甘油假丝酵母酸性磷酸确酶突变株 的选育及其性质研究 曹钰耿作献王正样诸葛健 C无蠕轻工犬举牲群甘油中心 旺苏214036) 摘要运用化学诱变法从高产甘油的工业生产菌株一产甘油假缝酵母CCandlda 型酸性磷酸礴酶缺失突变株；另一类为对磷谰节不敏感的部分去阻遇调节突变株． 并研究其发酵性能． 关键词产甘油假丝酵母，诱变．酸性磷酸聃酶 的一株假丝酵母新种．在长期的研究和工业化过粒中发现遮株商产甘油的耐高渗压的假篮 酵母对培养基中的磷含量报敏感．磷是影响甘油发群效率的主妥因素之一．而且甘油的生产 量与磷源的种类无关．便与总磷曩青关n1．在研究碑在谈假盐酵母甘油生产过程中的作用 时．选择酸性磷酸酗酶选一涉及磷输送和产甘油途径中性化最后一步反应的酶。通过研究 培养基中不同浓度的磷对该酶的影响和谈酶对这株产甘油假垃酵母产甘油过程的影响来阐 述磷在此菌株高产甘油的过程中所起的作用．为该菌高产甘泊的代谢机理的研究提供初步 探索．为此通过化学诱变的方法，选育酸性磷酸醯酶的突变株，并对甚发酵性能进行了研 究． 1材料和方法 1．1菌株 WL2002-5(H’)扶黄嘱呤缺陷型菌株由无铝轻工犬学发 Candtdaglycero船捃7-．huge 酵甘油研究设计中心保藏及提供，由沈微等缔选获得”1： 1．2培养基 基本培莽基(MM){醇母氮基(Di托o)6．7B，L-葡瑚糖209tL 发酵培莽基(FM)t葡萄糖250e．儿-尿綦2乩．玉米浆5m儿 完全培养基(YEPD)t蛋白脒209，L．酵母膏lO叽，葡萄糖20叽 化学成份限定性培井基(CDM)t 硫酸铵sg／L，葡萄舞loog／z,．硫酸链O．se／z．．氯化饵0．19亿． 硼酸500ugtL，磷馥铜40ugrL．碘化钾100ug厶氯化铁200ug／L。 硫酸锰400ug／L．。幅酸铵200uE／L,．硫酸锌400us,L． 磷酸=氨钾根据要求设定 低磷CDM，含磷酸二氮钾40mg／Lt尚碑CDMI古磷酸=氲钾S00mg／L ·培葬次黄嘌呤缺陷型菌株时朴加90mg／L次黄嘿呤 Ij酸性磷酸酯酵的测定’ 离心收集培井一定时间的茸体，用水洗涤2^．3次后悬浮手lmlO．0$moJ／l州4．0的醋段 缓冲液中．测定在640nIn下的吸光度．在350c预热过的反应管中加入650ui的酌酸缓冲帔 和100ul的菌悬{戎预热10～15min后．加入250ui 2、S6mg／ml的pNPI,．准确反应IO分钟， 加A】O％TCA2mJ终止反应，离心取上滑液2ral。再加入2rat的增和№：C现溶液调节反应 液的pH为碱性．使其显色．测定在420nrn下的吸光虚． 酶活单位u定义为单位菌体单位时问分解产生lumol对硝菇荤酚所需要的酶t． 1．4酸性磷酸醣酵突变探的筛选… 用于诱变的细胞在完全培弊基中30—32。C摇瓶培井16～lB小时．离心收集茁体。悬 浮于无菌生理盐水中．制成革细胞悬浮液，加入NTGO．Img／m!诱变40rain．离心终止诱变． 稀释涂布于高磷CDM培井基和低碑CDM培莽基平扳，恒温培井I～2夭．菌薄长成庙， 以上溶于pH4．0的0．05M醋酸缓冲液)在30。C保温30～60rain．若产生酸性磷酸醣酶． 一7R一 曹钰等 产甘油假丝酵母酸性磷酸酯酶突变株的选育及其性质研究 菌落会变为深红色，若无酸性磷酸酯酶产生 则菌落仍为白色．由于染色并不杀死细胞 因而可以直接从染色后的平扳上挑出突变株 涂布于完全平板上纯化…． 1．5糖含量、甘油浓度测定… 葸酮法铡定残糖，变色酸法测定甘油含量． 1．6十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝腔电泳(SDS) 用反复冻融和细胞破碎仪从18小时的培养物制备全菌体蛋白样本．制各10％的分离胶 及5％的浓缩胶，加样20ul，30mA下电泳4小时．考马斯蓝染色显示结果． 2结果 2．1诱变剂量的确定