苯丙素甙对MKN45细胞端粒酶活性、端粒长度和细胞周期的调控研究.pdfVIP

2000年中国博士后学术大会论文集 teins，Myocardialinfarct，Extracellular signal—regulatedkinases，pig 【作者简介1刘秀华，女。1957年出生，山东人，1987年获北京医科大学医学博士学位。主要从事 冠心病心肌缺血保护的基础与临床研究。 苯丙素甙对MKN45细胞端粒酶活性、 端粒长度及细胞周期的调控研究’ 张方信国 贾忠健① 魏亚明。 邓芝云@ 郑荣梁⑦ 马 力⑦ (④兰州大学化学化工学院；⑦生命科学学院，兰州730000；③兰州军区总医院实验科．兰州730050) 摘要 针对端粒酶的靶向抑制筛选具有抗癌活性的天然产物，是一项既有 潜在应用价值又有创新性的研究工作o／本文应用端粒酶PCR ELISA法，Sourthemblot杂交及流武细胞技术对苯丙素甙(verbas— eoside)在体外作用^皿(N45细胞后检测分析发现，苯丙素甙在一定 浓度范圈内抑制端粒酶活性，但不能直接抑制细胞上清中的端粒酶 活性。1用端粒酶半抑制浓度剂量作用细胞后，细胞出现端粒长度缩 短、G1亚二倍体峰及G2／M阻滞，表明苯丙素甙诱导肿瘤细胞分化、 调亡可能是受端粒一墒粒酶。细胞周期的依赖性调节，提示端粒酶抑 制、端粒缩短及G2／M阻碍滞可作为肿瘤抑制靶向筛选的重要指 标。 美键词 苯丙素甙端粒长度 端粒酶抑制剂 细胞周期 肿瘤治疗 端粒酶活性在恶性肿瘸中高度特异表达已成为目前癌症研究的理想靶点之一u’2一。 针对端粒酶设计的生物靶点药物，既表现出对恶性肿瘤细胞的生长、增殖及端粒酶活性 的抑制效应，又提供了一种寻找针对肿瘤分子靶点药物的筛选方法。 从中药马先蒿中提取的苯丙紊甙化合物(phenylpropanoidglumsides，PPG)，是生物 体的组成物质及其代谢产物。它既不同于普通的化疗药物，又不同于一般的端粒酶抑制 剂，其结构独特，生物活性广泛，兼有真接的抑瘤作用和间接的生物学调节效应”3，非常 适于端粒酶的靶向抑制研究。 但目前在肿瘤中仍缺乏端粒及端粒酶的调节信息和筛选这类天然产物的敏感手段。 blot杂交及流式细胞技术，选用已在体外试验 本文采用端粒酶PCRELIS法、Sourthem ·国家博士后基金赘助厦国家自然科学基金。 医药学与生物学分册 中有肯定抗癌活性的苯丙紊甙．verbascoside进行端粒酶的靶向研究，以获取在肿瘤中抗 端粒酶干预的调节机制，指导抗癌新药合成。 1材料与方法 1 1细胞、药物和试剂 人胃腺癌细胞株MKN45在含10％d、牛血清RPMIl640培养基中培养，由第四军医 大学全军消化病研究所提供，苯丙素甙(verbascoside，纯度98％)由本院有机化学研究 所分离鉴定，端粒酶PCRELISA试剂盒由德国宝灵曼公司提供，DNA纯化Kit、内切酶、 物工程公司合成，【7_32P3ATP及(*”P)CTP均由北京亚辉公司提供。 1 2端粒酶活性测定 于6孔培养板加入每孔2×加4／“细胞lral，贴壁后加人不同浓度的verbascoside(溶 于灭菌蒸馏水中)，实验对照孔仅加灭菌蒸馏水，阴性对照为RNase(华美公司)处理，阳性 对照为293细胞(试剂盒提供)，培养48h，收集同时胎盘兰染色光学显微镜下观察计数 细胞数无显著下降的处理细胞，PBS洗2次，一80℃保存。细胞裂解上清的制备、RT- PCR扩增及扩增产物检测均按试剂盒说明操作进行，在酶联免疫检测仪(华东电子管厂) 0．2为阳性)，再取药物浓度的对数值和端粒酶活性的抑制百分率[(1一实验：fLz∑A／对照 孔△A)×luoJ作线性回归求出端粒酶活性的半抑制浓度(IC50)。 1．3端粒(telomericrestriction[ragements，TRF)长度分析 x 取2 i04／ml 分子杂交操作”1，分别进行T4多核苷酸激qTTAGC记)