水稻简易RNAi载体构建及沉默效果鉴定.pdfVIP

一 !慧 ONines 搬髓熊镏擒嫩 獬 ／ … 装ystem：http：w／w／茹w．jaboitecho．rg —帕■J_■-_『 2o14,7 ： 水稻简易RNAi载体构建及沉默效果鉴定 刘燕霞 彭廷 赵亚帆 杜彦修 张静 李俊周 孙红正 赵全志 河南省粮食作物协同创新中心，河南省水稻工程实验室，农业部黄淮海作物生理生态与耕作重点实验室，河南农业大学，郑州450002 通讯作者，sunhongzheng@foxmail．com；qzzhaoh@126．com 摘 要 RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法，为了快捷高效地构建水稻(简易RNAi 表达载体，本研究采用简易RNAi构建法，设计3’末端9个碱基互补的正向和反 向寡聚核苷酸引物，通过 聚合酶延伸成为具有反 向重复序列的小干扰片段。以pCAMBIA1301一Gtl3a为表达载体，将小干扰片段 与表达载体经过一次双酶切与连接得到RNAi载体 。用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法得到水 稻(Oryzasativassp．japonica)转基因株系后，用叶片GUS染色和qRT-PCR法，对RNAi转基因水稻和野生 型日本晴叶片GUS组织活性和籽粒中 目的基因表达量进行检测 。水稻叶片GUS染色结果显示，有 10株 转基因水稻叶片切 口处呈现蓝色，而野生型无显色反应，说明RNAi载体T-DNA区域的基因己整合到水 稻基因组上，并表达。在mRNA水平上转基因水稻籽粒 中目的基因相对表达量降低至 18％～55％，差异极 显著(P0．01)，表 明整合在水稻基因组上的小干扰片段能降低 目的基因的表达水平。籽粒灌浆成熟后对 10株转基因水稻及野生型 日本晴籽粒的单粒重、粒长、粒宽和厚度分别进行测量 。与野生型 日本晴相 比，转基因水稻籽粒单粒重发生显著性降低(P0．05)，籽粒变小，长和宽都发生显著性变化(P0．05)，说明 简易RNAi载体对水稻 目的基因的表达起到很好的沉默效果。本研究不仅为利用简易RNAi构建法研究 水稻功能提供了依据，也为快捷高效地研究水稻基因功能提供了基础资料。 关键词 水稻，RNAi载体构建，沉默效果 Construction ofSimpleRNAiVectorand Identification ofSilencing EffectinRice(Oryzasativassp．japonica) LIU Yan—Xia PENGTing ZHA0、，a—Fan DU Yan—Xiu ZHANG Jing LIJun—Zhou SUN Hong—Zheng ZHAOQuan—Zhi CollaborativeInnovation CenterofHenan GrainCrops，RiceEngineeringLaboratoryofHenan，Key laboratory ofCropEcophysiologyand FarmingSystem inHuanghuaihaiRegion，HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002，China Correspondingauthor,sunhongzheng@foxmail．com；qzzhaoh@126tom Abstract RNA1nterference(RNAi)techniquehasbeenusedongenefunctionresearchfrequently．Inorder toconstructakindofsimpleRNAiexpressionvectorwhichisadaptedtorice(Oryzasativassp．japonica) rapidlyand