LIMK1-siRNA真核载体的构建及在人软骨细胞中的蛋白表达.pdfVIP

世界中西医结合杂志2014年第9卷第9期 WorldJournalofIntegratedTraditi0na1andWesternMedicine 2014，Vo1．9，No．9 ·983 · · 博 士论 坛 LIMK1一siRNA真核载体的构建及在人软骨 细胞中的蛋 白表达 李振华 丁爽 赵长伟 朱立国 摘【要】 目的 构建LIMK1一siRNA真核表达载体，为骨关节发病机制的研究奠定基础。方法 合成3条LIMK1的小RNA分子的寡聚脱氧核苷酸链，重组质粒测序 ，瞬时转染人软骨细胞 ，采用 Westernblot检测LIMK1表达情况。结果 Westernblot检测LY3号质粒的细胞中LIMK1蛋白表达明 显下调，经通用引物对 LY3号重组质粒测序鉴定，与设计序列核对完全相符。结论 成功构建 LIMK1一siRNA真核表达载体 ，有效沉默了人软骨细胞中LIMK1蛋白表达。 【关键词】LIMK1；siRNA；真核载体 【中图分类号lR318 【文献标识码】A 【DOI】10．13935／j．cnki．sjzx．140925 ConstructionofLIMK1一siRNA EukaryoticVectoranditsProteinExpres- sion inHumanChondrocyte LIZhen—hua-_，DING Shuang。ZHAO Chang—wei。 ZHU Li—gu0。 ， ， (1．ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700；2．AffiliatedHospitalofChangchunUniver- sityofTraditionalChineseMedicine，ChangchunJilin130021；3．WangjingHospital，ChinaAcademyofChi— neseMedicalSciences，Beijing100102) 【Abstract1 Objective ToconstructLIMK1一siRNAeukaryoticvectorSOastolaythefoundationfor thestudyonthepathogenesisofosteoarthritis．nethods ThreeLIMK1smallRNA molecularoligodeoxynu— cleotide(ODN)chainsweresynthesized，therecombinantplasmidwassequencedandhumanchondrocytewas transientlytransfected．Western blotmethodwasadoptedtodetermineLIMK1expression．Results Itwasde— temr inedinWesternblotthatLIMK1protein expressionwasdown—regulatedapparentlyinLY3plasmid cells．LY3recombinantplasmidsequencingwasidentifiedwithuniversalprimer，anditwasfoundthatthere— suhwascompletelyincompliancewithdesignedsequence．Conclusion LIMK1一siRNA eukaryoticvector issuccessfullyconstructed，whicheffectivelysilencesLIMK1proteinexpressioninhumanchondrocyte． 【Keywords】 LIMK1；siRNA；EukaryoticVector 骨性关节炎是临床常见的疾病之一，近年来研 材料与方法 究发现细胞骨架在力学信号转化为生物化学信号 过程中发挥重要生物学作用，通过前期研究证实co— 一 、 实验材料 filin通路通过显著活化参与到机械力诱导骨I生关节