禽流感病毒RT-PCR与多重RT-PCR检测技术的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会论文集 张应国1，宋建领：，胡媛媛2，王金萍：，张富强2 (1．云南省兽医防疫总站，云南昆明650001；2．云南省热带亚热带动物病毒病熏点实验室，云南昆明650224) 摘要：基于目前已知禽流感病毒基质蛋白、血凝紊、神经氨酸酶基因，研究建立了A型、H5、NI、H9、N2亚型特异性 流感及相关病毒分离物，其结果与传统病毒分离鉴定完全一致，具有敏感性和高特异性，且与相关病毒或其它亚型无 法比较，二者H5NI、H9N2贬型鉴定结果完全吻合。结果表明该方法具有快速、简便、经济、安全、敏感、特异等优点，可 作为临诊样品中禽流感病毒型及IISNl、H9N2皿型鉴定和诊断的有效方法。 关键词：禽流感病毒；血凝素；神经氨酸酶；多重RT-PCR 禽流感(Avianinfluenza，AI)又名欧洲鸡瘟、真湾)、H9N2亚型禽流感病毒。 fowl 《世界卫生组织(WHO)动物流感诊断和监测手 性鸡瘟(trulyplague)是由A型流感病毒 virus (InfluenzatypeA)引起的一种禽类的感染和疾 册)(2002年)、《世界动物卫生组织(OIE)疫病诊断 influenza 病综合征。禽流感病毒(Avian virus，AIV)试验和疫萤标准手册)(2004年)、国家标准及农业 属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属行业标准规定禽流感诊断及检疫技术包括：病毒分 (Influenza A virus)A型流感病毒(Influenza离鉴定、免疫荧光、RT-PCR、血清学试验(血凝抑 type viruses)成员，病毒粒子表面分布密集的钉状物或突制、琼扩、ELISA及微量中和试验)、抗原捕捉 起物，包含血凝素和神经氨酸酶。病毒基因组由单 ELISA、免疫酶试纸、鸡静脉接种致病性试验、神经 股、负链、8节段RNA组成，编码10个基因，按片段氨酸酶及神经氨酸酶抑制试验。其中病毒分离鉴定 大小依次为：聚合酶与RNAm7G帽结合区(PB2)、 和RT-PCR具有很高的敏感性和特异性。目前国内 聚合酶延伸区(PBl)、聚合酶(PA)、血凝素(HA)、核外研究建立A型、H5、H7亚型、N1、N2亚型、 蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1、M2)、 非结构蛋白(NSl、NS2)。所有A型流感病毒核蛋定技术，建立禽流感病毒及相关病毒多重PCR鉴 白、基质蛋白具有共同型特异抗原。病毒血凝索和 别诊断技术，经RT—PCR扩增结合序歹IJ分析对H7 神经氨酸酶抗原性差异确定亚型的划分，目前已知 亚型高致病性及低致病性毒株进行毒力鉴定取得 血凝素共有15种亚型(H1。ms)、神经氨酸酶共有 9种亚型(N1一N9o我国曾报道过H5N1、H5N2(台RT—PCR及多重实时RT-PCR诊断技术，并采用核 酸探针对扩增产物进行杂交分析。建立H5贬型高 基金项目：云南省科技攻关项目(2004NG-01)；农业部 致病性及低致病性毒株基于核酸序列扩增 948项目(2004-Z41) 作者简介：张应国(1966一)，男，硕士，高级兽医师，主要 NASBA检测技术。RT—PCR技术仍然是当前禽流 从事动物疫病诊断研究． 通讯作者：Tel：(0871)5016575， 感诊断研究的热点。比对分析已知禽流感病毒基 E-mail：zfql968@yahoo，com．cn．因组保守区，发现目前已有A型及H5、N1、H9、N2 —88— 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会论文集 亚型RT—PCR的敏感性和特异性存在不足。据此本