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来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究.pdf
中国农业科技导报，2015，17(1)：102—108
JournalofAgriculturalScienceandTechnology
来源于枯草芽孢杆菌的漆酶 cotA基因克隆与
表达及其酶学性质研究
余小霞， 刘晓青 ， 田 健 ， 伍宁丰
(中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)
摘 要：漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶，在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂 白等工业中有重要
的应用价值。从枯草芽孢杆菌 168菌株中克隆漆酶 cotA基因，全长 1542bp，编码 513个氨基酸，外加一个终
止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta(DE3)菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化，获得的重组
酶蛋白CotA的最适反应温度为60~C，最适 pH为4．5。该酶在6O℃具有较好的热稳定性，保温90min后仍有
71．70％的剩余酶活。最适反应条件下 ，重组酶对ABTS的K 为63．9±5~mol／L，koat为39．1+1／s，最大反应速率
为0．005t~mol／Lm·inm·g，且在最适反应条件下，微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活 (557．8U／mg)
是低温诱导法 (0．2U／mg)的2655．4倍。因此 ，通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。
关键词：漆酶；微好氧发酵；基因克隆；基因表达
doi：10．13304／j．nykjdb．2014．415
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1008—0864(2015)01—0102—07
GeneCloning，ExpressionandCharacterizationofcotA ，
aLaccasefrom Bacillussubtilis
YU Xiao—xia，LIU Xiao-qing，TIANJian，WUNing·feng
(BioteehnologyResearchInstitute，ChineseAcademyofA culturalSciences，Beijing100081，China)
Abstract：Asamuhicopperoxidase，laccase isimportantforitsapplicationsin industriessuch asenvironmental
protection，biologicaleneryg ，foodindustry，andpaperbiobleaching．Inthispaper，full—length sequenceofcotAgene
from 168strainsofBacillussubtiliswasclonedbyPCR amplification．ThesizeofthelaccasegenecotA is1542bp．
consistingofoneopenreadingflame．whichencodesapolypeptideof513aminoacidsandaterminationcodon．1’he
cotAgenewasclonedandexpressedinE．coliTransetta (DE3)undermicroaerobicconditions．Therecombinant
DroteinCotA waspurifiedbyNi—NTA columnandcharacterized．TheoptimaltemperatureandpH ofCotAwere60℃
and4．5．respectively．Thisenzymeshowedbetterthermostabilityat60℃ ．Therewasstill71．7O％ residualenzyme
activityafter90min heatpreservation．Undertheoptimum reaction condition，the Km，k tand Vm ofpurified
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