口服环丙沙星引起猪肠道大肠杆菌耐药性变化.pdfVIP

口服环丙沙星引起猪肠道大肠杆菌耐药性变化 黄康 王红宁 曾博 徐昌文 程菡 雷昌伟 李然 邓春朋 四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，生物资源与生态环境教育部重点实验室， “985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台 四川，成都610064 为了探明口服环丙沙星是否引起猪肠道大肠杆菌耐药性的变化，本实验在规模化猪场随机 挑取13头60日龄断奶仔猪，连续喂猪 （150mg/头）环丙沙星30天，对13头猪采集的混合粪样分离出的大肠 杆菌80株，进行了最小抑菌浓度(MIC)的测定和六种氟喹诺酮类耐药基因(qnrB，qnrS，oqxAB，aac(6) Ib-cr，gyrA，partC)的PCR检测，结果表明投药后3天大肠杆菌的MIC值明显升高，停药后26天MIC值明显 降低；PCR结果显示投药后的大肠杆菌中gyrA基因第83位和第87位位点发生了突变，partC基因第80位基 因发生了突变；而停药后的大肠杆菌中gyrA基因只有第83位位点发生了突变；质粒介导的四种耐药基因 (qnrB，qnrS，oqxAB，aac(6)Ib-cr)没有检测到。根据本研究结果建议规模化猪场对断奶仔猪投环丙沙星的 时间控制在3天以内，可以减少耐药性的产生。 肠道大肠杆菌；耐药性；最低抑菌浓度；突变 第三篇疾病防治 1材料和方法 1．1投药方法 1．1．1投药本实验对13头断奶仔猪每天投药，投药量为150mg／头，时间安排在每日中午喂料时进行，投药方 法为湿拌料，即先将药物溶解于水中后，然后在拌料时将药水逐步倒入饲料中，充分与饲料混匀进行给药。 拌料用的饲料量为该次饲料饲喂量的一半，另一半饲料在投药后再加入，让猪在30分钟将药物吃完后再进 行补料。 1．1．2样品采集实验对猪粪便样品进行采集，投药后两天间隔两天取一次样，六天以后问隔五天取一次 样，总共采样16次。采集每个实验组的新鲜粪样，采样时，在每个组的猪圈地面上随机选取5个点的新鲜猪 粪进行采集，同一个组的粪样混匀后装一起，不同组的粪样分开。粪样装入封口袋中挤掉空气后密封，标 记后放入冰盒中，当天送往实验室进行后续检测。 1．2主要试剂 乳酸环丙沙星购自四川鼎尖动物药业有限责任公司。平板计数琼脂(PCA)，伊红美蓝琼脂购自青岛 高科园海博生物技术有限公司。Ex 公司。 1．3菌株 称取0．29的粪样用PBS缓冲液处理后取上层菌悬液均匀涂在伊红美蓝培养基上，挑取黑色有金属光泽 的菌作为实验菌株。 1．4大肠杆菌耐药表型MICs坝0定 采用琼脂两倍稀释法测定不同药物组的猪肠道大肠杆在不同的采样时间点上对环丙沙星的最低抑菌 接种，方法参见多点接种仪MIT—P60说明书。 1．5六种氟喹诺酮类耐药基因的PCR检测 六种耐药基因的名称及相关引物和片段大小等情况见表1．3 表1 耐药基因基因PoR检测引物表 279 四川省畜牧兽医学会2012年学术年会 u PCR反应采用ExTaq酶，体系25L。反应条件经优化：95。C5mil3：95。Cimin、退火30s(温度见表 由上海生工测序，序列结果用NCBI-BLAST比对后确定基因的正确性和突变点。 2 结 果 2．1大肠杆菌分离鉴定 每组都从伊红美蓝培养基上随机挑取5株黑色有金属光泽的菌，总共80株。将挑取的菌株进行菌落 PCR，引物为16SrDNA通用引物。PCR产物的测序结果用NCBI—BLAST比对后确定是大肠杆菌。 2．2细菌耐药表型的MIC测定结果 80株已经鉴定的大肠杆菌，在多点接种仪MIT—P60上点样，MIC结果请见图1 O 5 10 ’● 舶 ∞ ∞ ∞ 柚 ∞ ∞ 啊 ∞ 一 DW 图1 环丙沙星投药组不同日寸I司点大肠杆豳MIC但 2．3 PCR检测和突变位点分析结果 2．3．1 gyrA基因突变位点分析结果 停药后的菌株第83位位点都发生了突变，由丝氨酸突