人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)酶联免疫分析试剂盒使用说明书.doc

人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）酶联免疫分析试剂盒使用说明书 检测范围： 96T 8μg/L -160μg/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）水平。用纯化的人高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1） ，再与 HRP 标记的高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1 瓶 2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品（320μg/L） 0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板 12 孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂A 液 6ml×1瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 160μg/L 5 号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 80μg/L 4 号标准品 150μl的5 号标准品加入150μl标准品稀释液 40μg/L 3 号标准品 150μl的4 号标准品加入150μl标准品稀释液 20μg/L 2 号标准品 150μl的3 号标准品加入150μl标准品稀释液 10μg/L 1 号标准品 150μl的2 号标准品加入150μl标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止液后 15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式， 计算出样品浓度， 再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5） 。