IgG抗体的提取及鉴定总结.pptVIP

实验步骤 人血清 提纯物 兔抗人血清 双扩散 电泳 + - * 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG * 酶联免疫吸附试验原理 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。 * 直接ELISA 间接ELISA 双抗体夹心法 包被(未知抗原） 加入酶标抗体 洗板 加底物 加终止液 包被(已知抗原） 加入待检标本 （未知抗体） 加入酶标第二抗体 ﹙抗抗体﹚ 洗板 加底物 加终止液 包被(已知抗体） 加入待检标本 （未知抗原） 加入酶标抗体 洗板 加底物 加终止液 原理示意图 * 人血清IgG抗体的检测 ——直接ELISA法 测定原理： 将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人IgG抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被IgG结合，最后形成IgG-酶标羊抗人IgG抗体复合物，加入底物产生显色反应。 * 包被：用包被缓冲液将纯化抗体稀释至0、2、4、6、8、10mg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释液，4℃过夜。 加酶标抗体：每孔加入稀释至工作浓度的酶标抗体100μl，37℃孵育1h。 洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。 洗涤：手工洗板，弃液拍干，重复5次 加底物显色：每孔加底物液50μl，置37℃孵育15min。 终止反应：每孔加入50μl的2M H2SO4，混匀 【步骤】 封闭：每孔加入封闭液0.1ml， 4℃孵育1h 。 * 《医学免疫学与免疫学技术实验》 贵阳医学院免疫学教研室 人血清IgG的提取及鉴定 2014-04-22 人血清IgG的提取及鉴定 离子交换层析法提取人IgG 血清IgG鉴定 人血清IgG的提取及鉴定 离子交换层析法提取人IgG流程： DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清） 装柱、平衡 上样和洗脱 DEAE-纤维素再生 人血清IgG鉴定 ： 洗脱液抗原性鉴定—琼脂双扩散 纯度鉴定—免疫电泳 回收率的测定—分光光度法 IgG回收量的测定-直接ELISA 离子交换层析的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。 离子交换层析的基本过程 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 离子交换剂 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。 纤维素－O－CH2－COO-－Na＋ 基质 电荷基团 反离子 阴离子交换剂 二乙氨乙基纤维素，弱碱性 DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。 人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理 人IgG特性: 血清含量：9.5-12.5 mg/ml ；血清中的IgG属于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白（pI:4-5 ）。 DEAE-纤维素提取IgG原理： 在pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附， IgG不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。 实验步骤 1、DEAE-纤维素预处理： 强碱处理 0.5N NaOH ?抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强酸处理 0.5N HCl ?抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强碱处理 0.5N NaOH ?抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） PH7.4 0.01M PB液浸泡?抽滤、浸泡 2、装柱、平衡固定层析柱 装 柱：柱高度、无分层、无气泡 3、样本（人血清）准备 抽静脉血?分离血清?透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜） 4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用） 实验步骤 5、上样、洗脱、收集洗脱液 上样 流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清） 洗脱 流速30-40ml/cm2/h 收集 5ml/管 （20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）6、DEAE-纤维素再生 2M NaCl 洗脱其他血清蛋白