消减杂交法鉴定喹烯酮诱导差异基因.pdfVIP

第十二次菊理毒理学术讨论会 综述与呈文 消减杂交法鉴定喹烯酮诱导的差异基因 张可煜，王霄呖，王米，张丽芳，费陈忠，李涛，薛飞群’① (中国农业科学院上海兽医研究户斤／中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留重点开放实验室，上海200241) 摘要：【目的】喹烯酮具有较大的细胞毒性和体外遗传毒性，但其毒性机理目前仍知之甚少。为研究喹烯酮毒性作用的分 子机理，【方法】本研究以HepG2细胞为研究材料，利用抑制性消减杂交技术构建喹烯酮暴露后的双向消减杂交cDNA 文库，挑选其中500个克隆进行基因序列分析，并通过荧光定量PcR对部分差异的相关基因进行验证。【结果】在双向消 减杂交cDNA文库中阳性克隆基因测序后获得喹烯酮暴露诱导的差异表达基因160余个，其中表达上调的基因有90多 2 个，表达下调的基因60多个。荧光定量PCR验证结果与消减杂交结果一致。【结论】本研究构建起喹烯酮诱导HepG 细胞差异表达的正反向基因文库，筛选出差异表达基因，为比较全面的揭示喹烯酮毒性分子机理奠定了基础。 关键词：喹烯酮；抑制性消减杂交；差异表达基因；作用机理 喹嗯啉一1，4一二氧类兽药是我国乃至全世界应用最多的非激素类抗菌促生长药物。随着这类药物在畜牧养 殖业使用的扩大，人们发现喹嗯啉一1，4一二氧类兽药如喹叨嗪、卡巴氧、喹乙醇等均具有相应的毒性。例如，喹叨 嗪已被证实具有较强的光敏毒性和致癌可能性；卡巴氧能诱导体外细胞遗传物质改变和导致动物患良性肿瘤；喹 乙醇在体外能诱发细胞DNA损伤、突变和s期停滞；乙酰甲喹具有急性毒性大、肾上腺损伤等毒性¨。3J。前期已 经证实喹烯酮也具有细胞和遗传物质损伤等毒性以及细胞凋亡和s期停滞等现象。但是喹烯酮乃至整个喹嗯啉 残留靶标和最大残留限量仍不能科学合理的制定，如果能获得喹嗯啉类兽药的毒性分子机理，尤其是喹嗯啉兽药 与细胞遗传物质损伤相关的各种功能蛋白质相互作用机制的信息，将有助于该类药物的安全评价Hj。本研究主要 键分子提供理论基础，也为该类化合物的新药筛选提供毒性参考靶标。 1材料与方法 1．1供试细胞 肝细胞HepG2株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。 1．2 供试化合物及试剂 国GIBCO公司；PBs(pH7．2)，购自上海生工公司；二甲基亚砜(DMsO)，购自上海展云公司；相关配制和保存办法 如前章所述。 —SelectTMcDNASubtraction cDNAPCR kit、AdvaIltageTM GelExt瑚lction mRNA 司；DNAMarker、IPIB和x—Gal也购自宝生物工程(大连)有限公司；QLAquickkit、Oligotex Midi I(it为QIAGEN公司产品；氨苄青霉素为生物工程(上海)有限公司产品；pGEM—TEaLSy Fast 细胞购自Pmmega公司；Yeastextract、Tryptone为英国o】【oid公司产品；叫denPCR瞄t为天根生化科技(北 京)有限公司产品。 1．3 染毒与总RNA的提取 ① 基金项目：国家自然科学基金项目；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2012JB02) 作者简介：张可煜(1978一)，男，贵州桐梓人，在读博士，主要从事兽医药理毒理学研究。 $通讯作者：Tel：02lE—mail：fq)【ue@shvri．ac．cn ·49· 综述与至文 第十二次药理毒理学术讨论会 1．3．1 细胞培养和染毒 参照文献1，将细胞培养瓶中融合率达90％以上后消化分离细胞，并以2×106ceⅡs接种到100cm2细胞培养 养基做空白对照组。 1．3．2 总RNA和mRNA的分离纯化