携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达.pdfVIP

· 1856· 南方医科大学学报fJSouthMedUniv) 2008；28(10) 携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞 中的表达 王雪峰，何援利(南方医科大学珠江医院妇产科 ，广东 广州 510282) 摘要 ：目的构建及鉴定 bcl一2基因慢病毒表达载体 ，并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达。方法采用 PCR技术 从含有人6cf．2基因的质粒克隆模板 pCMV—SPORT6钓取 6cf一2基因．并将基 因克隆到慢病毒载体表达质粒 pGC．FU (含 EGFP基 因)中，构建慢病毒载体表达质粒 pGC．FU．6cf一2，通过酶切 、测序验证 6cf一2基 因后 ，将 pGC—FU．6c2．2质粒 和包装质粒 pHelper1．0、pHelp．er2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞 ，获得携带6cZ一2基因和EGFP基 因的重 组慢病毒GC．FU一6cf一2，并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞。通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和 目的蛋 白bc1．2进一步验证 pGC—FU—bc1．2在靶细胞 中的表达 。结果 (1)pGC．FU—bc1．2中携有正确 的bcl一2基因，并能在人类细 胞中表达 ；pGC．FU—bc1．2共转染包装细胞 293T能产生重组病毒 GC．FU．bcl-2；(2)目的基 因bc1．2能被重组慢病毒高效 地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞，并达到稳定的表达，荧光显微镜下能直接观察到GFP，Westernblotting能检测到 bcl一2蛋 白在靶细胞中的表达。结论 成功构建了携带bc1．2基因的重组慢病毒载体，转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳 定表达 bcl-2基 因，为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础 。 关键词：bcl一2；慢病毒载体 ；基因转移 ：人卵巢原代颗粒细胞 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1673．4254(2008)10—1856．04 Construction ofalentiviralvectorcarryinghumanbcl一2 geneand itsexpression in human ovariangranulosacells WANGXue—feng，HEYuan—li DepartmentofObstetricsandGynecology，ZhujiangHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510282，China Abstract：0bjectiveToconstructalentiviralvectorcarryinghumanbcl一2geneandinvestigateitsexpressioninhuman ovariangranulosacells(GCs)．MethodsHumanbcl-2genewasamplifiedfromtheplasmidpCMV·SPORT6usingPCRand subclonedintothelentiviralvectorpGC．F1JtoconstructthelentiviralexpressionvectorpGC．FU—bc1．2．Thebc1．2genenisert wasconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing． Tlierecombinantlentivimsesgeneratedby293T cells co—transfeetedwith pGC—FU—bcl-2andthepackagingplasmidspHelper1．0 andpHelper2．0． Theresultingrecombinant 1entivimsGC．FU—bc1．2carryingbcl一2andEGFPgeneswerehtenusedtoinfecthumanovariangranulosacells．EGFPand bcl一2proteni expressionsin293T andhumanovarianGCsweredetectedbyfluorescentmicroscopenadWestern blotting． ResuRsTheplasmidpGC-FU—bcl一2c