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作者姓名：张俊毅 论文题目：δ-catenin 和p120ctn在胞浆中通过与E-cadherin非竞争性结合促进非小细胞肺癌的恶性表型 黏附分子Catenin家族中的p120ctn和β-catenin与肺癌侵袭、转移的关系已有报道，但该家族中的另一成员δ-catenin与肺癌的侵袭、转移是否有关尚不清楚。与p120ctn一样，δ-catenin既可与E-cadherin的JMD（juxtamembrane domain）位点结合，入核后也可与转录抑制因子Kaiso结合。这些信息提示我们，δ-catenin在肿瘤的恶性表型中可能同样扮有重要角色。Burger 等报道与良性前列腺增生相比，前列腺癌中δ-catenin的转录明显上调，其蛋白表达也显著增加。然而，肺癌组织中δ-catenin的表达情况如何、δ-catenin的表达与非小细胞肺癌（NSCLC）临床病理因素之间存在怎样的关系尚不清楚，δ-catenin和p120ctn与E-cadherin分子中JMD位点的结合是否存在竞争性等也需要证实。 最初认为δ-catenin只表达于大脑神经元，且可与presenilin 1结合，参与早老性痴呆（Alzheimer’s disease）的发生发展。后又发现δ-catenin对于神经元突触功能的维持很重要，并可作为支架蛋白而参与信号向下游的传递等。有文献显示，在MDCK细胞中过表达δ-catenin可以改变细胞形态，包括诱导层形足板的形成等。最近又有文献报道，δ-catenin作为一个上游刺激信号的整合子可以促进下游Rho活性的降低以及Cdc42和Rac活性的升高，从而导致了突起的形态变化。我们知道小GTPases是细胞骨架重构、信号转导和基因表达通路的重要调节因子，我们也发现p120ctn通过小GTPases而影响肺癌细胞的侵袭和转移。因此，我们推测δ-catenin与肿瘤侵袭和转移之间很可能存在着联系。 在本研究中，我们检测了115例NSCLC样本中δ-catenin、p120和E-cadherin的表达情况并探讨了它们的表达与临床病理因素的关系。同时，在肺癌细胞系中分别过表达或干扰δ-catenin和p120ctn，并借助免疫共沉淀的方法探讨了两者是否存在与E-cadherin的竞争性结合以及δ-catenin对肺癌细胞小GTPases活性和生物学行为的影响。 组织标本与病人资料 115例NSCLC患者的标本及20例癌旁正常肺组织（距原发性肿瘤边界5cm以上）标本收集自中国医科大学第一附属医院病理科1998～2005年存档蜡块。115例标本中包括50例淋巴结转移癌标本作为配对研究，其余65例标本具有完全随访资料。所有病例术前均未接受放疗和化疗。男性61例，女性54例，男女性别比1.1∶1，年龄33～80岁（中位年龄58岁）。按照International Union Against Cancer（UICC）于2002年修订的肿瘤pTNM分期标准：Ⅰ期18例，Ⅱ期39例，Ⅲ期56例，Ⅳ期2例。按照World Health Organization（WHO）肺癌分类标准：鳞癌54例，腺癌61例。为了验证免疫组化的结果，我们另外收集了30例新鲜肺癌及癌旁正常肺组织用于检测δ-catenin蛋白和mRNA的表达情况。 免疫组织化学染色 采用Streptavidin-Peroxidase（SP）免疫组织化学方法进行染色，检测δ-catenin、p120和E-cadherin在115例NSCLC标本中的表达及其与各临床病理因素之间的关系，也检测了其中50例原发灶与转移灶配对的标本中δ-catenin表达的差异以及 另65例随访标本中δ-catenin表达与患者预后的关系。 细胞培养，质粒构建与转染 人肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1（以下称SPC）培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中。将δ-catenin质粒（pCMV5-FLAG/δ-catenin）导入δ-catenin表达较低的SPC细胞系；选择干扰效果较好的δ-catenin siRNA序列导入δ-catenin表达较高的A549细胞系。 将p120ctn-1A 和3A质粒导入p120ctn中等量表达的A549细胞系和稳定干扰p120ctn的SPC细胞系；采用我们已经报道的p120ctn siRNA质粒和方法将该质粒导入A549和SPC细胞系。 Western Blotting与RT-PCR 应用Western Blotting与RT-PCR检测肺癌及癌旁正常肺组织中δ-catenin的蛋白和mRNA表达情况。 免疫共沉淀 为了验证δ-catenin和p120ctn是否竞争性地与E-cadherin上的相同位点JMD结合，我们在SPC和A549肺癌细胞系