海水养殖鱼类弧菌病病原生物学和其免疫防治.pdfVIP

生里查兰堂全鱼堑鳖些委员会第六次会员代表大会暨国际学术讨论会论文(摘要)集 —————————————————————————————————————————————————．_』 ： ==：：=：：二==：：二2 海水养殖鱼类弧菌病病原生物学及其免疫防治 吴灶和简纪常 广东海洋大学水产学院 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室 近年来，由于高密度集约化养殖所带来的多种负因子影响，海水养殖鱼类病害的种类、 发病频率及危害性逐年增加，其中弧菌病是海水鱼类养殖过程中主要病害之一，死亡率常在 80％左右，造成巨大的经济损失。2003年，我们从广东湛江特呈岛网箱养殖的红鳍笛鲷身上 分离、纯化到一株高致病性病原菌Ls一1。该菌为革兰氏阴性短杆菌，有运动性，菌落半透明， 最适温度28～30。C，需盐生长，氧化酶反应阳性，发酵葡萄糖不产气，不发酵肌醇，对弧菌抑 制剂0／129敏感。经API—ID32E细菌鉴定系统及弧菌科细菌生化鉴定管鉴定，该菌为一株溶 藻弧菌(Vibrio aginolyticus)；其对红鳍笛鲷的半数致死量为6．32×105cfu／mL。 首先，我们对溶藻弧菌的致病因子进行了研究，提取并纯化了溶藻弧菌的胞外产物(ECP)， 发现溶藻弧菌ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等多种酶活性，对青鲈、美国 红鱼和赤点石斑鱼等海水鱼类的红细胞有一定的溶解能力，ECP对小白鼠和石斑鱼的LD。。分别 为0．08 mg／g，对注射ECP组和对照组石斑鱼的血清生化指标及组织病变进行比 mg／g和0．17 较研究，发现均存在显著差异，故认为溶藻弧菌ECP在溶藻弧菌对石斑鱼的致病中发挥了主 要作用；进而根据Genebank中已发表的几种弧菌碱性丝氨酸蛋白酶基因保守序列设计两条引 PCR) 物，扩增出一条750bp条带，测序后根据测序结果设计引物，应用反向PCR(inverse 和巢式PCR(nestedPCR)技术克隆出溶菌弧菌致病性胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因(VAASP)侧 vulnificus)碱性丝氨酸蛋白酶基因同源性分别达到 parahaemolytitus)、创伤弧菌(Vibrio 了91％和82％，推测出的推导氨基酸的同源率分别达79％和75％。现正着手于对该基因的体外 表达工作。 其次，对溶藻弧菌的保护性抗原进行了筛选。我们还提取了溶藻弧菌的外膜蛋白(OMP)， 并对其在紫红笛鲷中免疫保护性进行研究。结果发现，不同浓度的OMP腹腔接种紫红笛鲷后 用4．8x 10 7cells／mL溶藻弧菌的免疫 OMP对1．24x 62．5％，免疫保护试验表明，注射0．1mL1．0mg／mL N端氨基酸测序，设计寡核苷酸探针，标记后钓取O～IPs 保护率达到70．7％。现在我们根据OlIlPs 基因序列的工作已基本完成。 再次，对机体的免疫学进行了研究。我们分别从赤点石斑鱼和紫红笛鲷的血清中分离纯 化了其免疫球蛋白IgM，对其特性进行了研究，发现赤点石斑鱼IgM重链的分子量约为80kD， 轻链分子量约为25kD，可以推断免疫球蛋白的分子结构可能是四聚体，类似于哺乳动物的IgM； 同时制备了紫红笛鲷IgM的高免血清，为研究紫红笛鲷的免疫反应提供了先决条件。 最后，我们还制备了多种溶藻弧菌疫苗，并对疫苗的效果进行了现场评价，得到了如下结 果：(1)溶藻弧菌外膜蛋白(oMP)亚单位疫苗可显著提高紫红笛鲷的溶菌活力等非特异性免 lO 中国水产学会鱼病学专业委员会第六次会员代表大会暨国际学术讨论会论文(摘要)集 疫因子的活力