Nogo-A在体外培养的少突胶质前体细胞的表达和缺氧后的变化.pdfVIP

泛珠三角围产医学会议 会议宣读 Nogo．A在体外培养的少突胶质前体细胞的表达及缺氧后的变化 唐军 钟琳 姚裕家 四川大学华西第二医院儿科 成都610041 哺乳动物的中枢神经系统(CNS)与外周神经系统(PNS)具有完全不同的重塑能 力。研究发现，PNS受损后可以再生，而CNS受损后则不能再生。对于其机理近年来 已作了大量的研究，其中Nogo基因的发现最引人瞩目。Nogo是位于CNS内的一种重 要的神经抑制因子。其中，Nogo-A被认为具有最强的抑制神经生长的作用。早产儿脑 maRcr 白质损伤(white damage，WMD)是早产儿围产期主要的疾病之一，它严重影响着早 产儿的存活及预后。神经胶质细胞损伤在早产儿WMD中占有重要地位，特别是少突胶 质细胞(OL)前体的受损和丢失，使脑白质筒鞘形成受阻，这些病理损害可能与脑瘫等 后遗症密切相关。因此，观察OL前体细胞上Nogo．A的表达及分布变化可能对进一步研 究早产儿WMD的病理机制及修复奠定实验室和理论的基础。本研究通过体外培养OL 前体细胞，制造缺氧模型；并用免疫荧光法及Westen印迹法观察Nogo．A在OL前体细 胞的表达及缺氧后的变化情况。 l材料与方法 1．1 OL前体细胞的体外培养及鉴定 取生后72h内的新生SD大鼠，，无菌取大脑，剔除脑膜及血管，0．03％胰酶消化8min， 细胞悬液，去除已贴壁的成纤维细胞。将细胞悬液注入预先用多聚赖氨酸打底的75cm2 的培养瓶中，培育箱孵育。每3天半量换液，培养7．8天。光镜下观察细胞，可见瓶底 已被星形胶质细胞铺满，上层可见散在的小圆形折光性好的少突胶质前体细胞。 恒温空气浴振动摇床120r／min，37℃，2h，全量换液以去除小胶质细胞等，再以 可除去体积较大的星形胶质细胞及成纤维细胞)，再取悬液800rPm离心lO分钟，用无 5ul／ml，体积比O．5％，PDGFlong／ml、 血清培养液(DMEM．F12，含O．5％胎牛血清及N2 bFGFlong／m)重悬细胞，转种于六孔细胞培养板中。每空已预先铺好用多聚赖氨酸打底 的血盖片。每2天半量换液。根据培养板中细胞的培养时间及分化程度，在不同的时间 段终止培养，经A285、04、01抗体作免疫荧光法鉴定，OL前体细胞系纯度90％。 1．2 OL前体细胞缺氧缺糖模型制备 170 泛珠三角围产医学会议 会议宣读 采用氧清除剂连二亚硫酸钠造成缺氧。 细胞转种后2天，弃去培养液，用无糖培 养基洗涤细胞2次，加入含连二亚硫酸钠终浓度为10mmol／L的无糖培养基继续培养1h， 造成细胞缺氧缺糖损伤模型。 1．3 Nogo．A在OL前体细胞的表达观察 cruz)为一抗，不作细胞打孔，阴性对照用血清代替一抗；滴加 NogoA(H．300)(santa FITC标记的羊抗兔二抗。荧光显微镜下观察，绿色荧光为阳性表达。镜下计数细胞荧 光与相差的叠加率，以百分率表示。 1．4 Nogo．A在OL前体细胞缺氧缺糖损伤后表达的变化 1．4．1 细胞随机分为正常组、损伤后10分钟、30分钟和60分钟四组，经相应处理后， 4℃离心25min，取上清。BCA测定试剂盒测定各样本蛋白质浓度。 1．4．2 用Westen印迹法检测细胞中Nogo-A的含量。在凝胶成像分析系统(美国， BioRad)中成像并测量特异性条带表达强度的区别。 度比值。所有数据均用x±S表示，损伤后各组分别于正常组比较，采用方差、方差齐 性检验，P0．05为差异有统计学意义。 2结果 2．1 Nogo-A在0L前体细胞表达的免疫荧光检测结果 结果显示，在OL细胞分离接种后第l天，Nogo-A就有阳性表达(图1)，绿色荧光 可见于细胞胞体及突起，但部分细胞未见阳性表达；第2天，Nogo-A阳性表达较第一 天增加(图2)，细胞荧光叠加表达阳性率达95％以上(图3)，绿色荧光出现在细胞整 个胞体及突起上；第4天，Nogo．A仍有阳性表达，主要在细胞胞体及突起的近端，较 长的突起远端未见荧光(图4)。 2．2 结果