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X蛋白乙型肝炎病毒真核表达载体G6PD论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的分别构建乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）S基因（包括Pre-S1，Pre-S2和S）和X基因的带FLAG标签的真核表达载体，并进行有效表达，进而通过高通量蛋白质技术获取与X蛋白相互作用的蛋白质复合物，以期为进一步研究乙型肝炎病毒外膜蛋白及X蛋白的功能打下基础。方法以质粒pcDNA3.1-HBV为模板，通过PCR技术扩增HBV基因组Large surface antigen（LS）、Middle surface antigen（MS）、Smallsurface antigen（SS）和X基因片段；将PCR克隆获得的目的基因片段分别插入真核表达载体pCMV-tag2B，构建重组质粒pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，并送测序鉴定。将鉴定正确后的目的基因表达载体分别转染293FT细胞，Western blot检测其表达。继而应用FLAG亲和层析柱分离HBX复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。选择三次实验中只在HBX复合体中鉴定的蛋白质作为进一步功能分析的侯选蛋白。通过免疫共沉淀和免疫共定位，进一步确认侯选蛋白G6PD与HBV-x蛋白相互作用。结果分别用相应内切酶酶切重组真核表达载体pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，各切出两个片段，大片段大小与pCMV-tag2B空质粒大小一致，小片段大小分别与对应目的基因片段LS、MS、SS和X大小一致，且测序结果表明，重组真核表达载体分别含有相应的完整的目的基因片段。Western blot检测结果表明，转染了表达载体pCMV-tag2B-LS、pCMV-tag2B-MS、pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X的293FT细胞分别在43KDa、34KDa、24KDa和17Kda处各出现了强反应条带。空白对照均未见相应条带出现。应用FLAG亲和层析柱，成功的分离出HBx复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。三次实验中，58个只在HBX复合体的蛋白质得到鉴定，包括G6PD。通过免疫共沉淀和免疫共定位，明确侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用。结论成功构建乙型肝炎病毒S基因和X基因的真核表达载体pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，并能正确表达。同时成功的分离并鉴定出HBx复合体，明确了侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用，为进一步研究乙型肝炎病毒X蛋白和外膜蛋白的功能打下基础。 【关键词】外膜蛋白；X蛋白；乙型肝炎病毒；真核表达载体；G6PD； 【篇名】乙型肝炎病毒基因（S、X）载体构建表达及功能研究 【目录】乙型肝炎病毒基因（S、X）载体构建表达及功能研究 英汉缩略语名词对照 5-6 摘要 6-9 ABSTRACT 9-10 前言 12-16 第一部分 乙型肝炎病毒 S 基因和 X 基因载体的构建及表达 16-26 1 实验材料 16-17 2 实验方法 17-22 3 实验结果 22-23 4 讨论 23-26 第二部分 HBX蛋白复合物的分离和鉴定 26-35 1 材料 26-27 2 方法 27-30 3.实验结果 30-33 4 讨论 33-35 小结 35-36 参考文献 36-39 文献综述 39-45 参考文献 42-45 附图 45-48 致谢 48-49 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 49-50