抗鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备和鉴定.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 抗鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 云1+ 白小飞1，刘红玉l，2，陈玉环1’2，殷秀辰1，张 (1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所1兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001； 2．东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030) tembusu 摘要：为制备抗鸭坦布苏病毒(Duck 将DTMUVE基因原核表达，目的蛋白纯化后免疫6周龄雌性BALB／c小鼠。按常规MAb技术方法，取其脾细 胞与骨髓瘤细胞SP／20融合，经间接ELISA方法筛选及3次连续克隆化共获得6抹稳定分泌抗DTMUVE蛋白的 结果表明这6株MAb均能识别DTMUV。DTMUVE蛋白MAb的制备为DTMUV准确快速的病原诊断和与 DTMUV感染相关的基础性研究提供了物质基础。 关键词：鸭坦布苏病毒；E蛋白；原核表达；单克隆抗体 鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(DTMUV)弓l 1 材料和方法 起的一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临 1．1 TA株、 床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传 病毒、载体及细胞系DTMUV 染病11-21。该疫病的传播相当的迅速，这给全国的养 DH5a、感受态细胞 pET．30a(+)、感受态细胞E．coil 鸭业带来了巨大的威胁。 DTMUV粒子有三种结构蛋白：核衣壳蛋白胞有本实验室制备。 1．2 实验动物9日龄～11日龄SPF鸭胚与6周 [c】，膜蛋白【PrM／M]和囊膜糖蛋白【E】㈣。E基因大 小约为l 龄雌性BALB／c小鼠均购自哈尔滨兽医研究所实验 500bp，由其编码的E蛋白是病毒粒子表 面最主要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇含有 动物中心。 DTMUV主要的抗原表位，在病毒感染早期即可诱 DNA 1．3主要试剂Taq 导机体产生中和抗体，从而引起宿主产生保护性的 I、T4 免疫应答，同时E蛋白还与细胞膜受体相结合并与 司；pMDl8．T、限制性内切酶Ec出I和X_ho 细胞膜融合而使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒 连接酶均购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶(HRP) 的吸附、穿入、致病性、组织嗜性、血凝反应、血 标记的羊抗鸭二抗、HRP／FITC标记的羊抗鼠IgG均 清特异性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关171。 购自KPL公司；小量病毒RNA抽提试剂盒、小量 本研究通过原核表达DTMUV的E蛋白，用纯DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公 化的蛋白免疫BALB／c小鼠，经3次亚克隆筛选出6 株稳定分泌抗DTMUVE蛋白特异性MAb的杂交瘤 细胞，为DTMUV的诊断试剂开发、新型疫苗研究 以及DTMUV致病机制研究等奠定基础。 购自中杉金桥生物技术有限公司。 一58— 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 1．4 E基因在大肠杆菌中的原核表达及纯化将构 行DAB显色，观察结果。 1．7．3 用DTMUV感染 建的阳性克隆质粒pMDl8-T-E与原核表达载体间接免疫荧光(IFA)检测