利用ATP 扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物.pdfVIP

Re se arch Pap er 研究报告 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica ( ) 49 6 : 826 - 830 ; 4 June 2009 ISSN 0001 - 6209 ; CN 11 - 1995Q http :journals. im. ac . cnactamicrocn 利用 ATP 扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物 1 1 ,2 1 1 1 ,2 ,3 陈颖 ,邹秉杰 ,朱术会 ,马寅姣 ,周国华 (1 中国药科大学生命科学与技术学院 ,南京 210009) (2 华东医学生物技术研究所 ,南京 210002) (3 南京大学医学院 ,南京 210093) ( ) ( ) 摘要 :【目的】腺苷酸激酶 adenylate kinase , ADK 和多聚磷酸盐激酶 polyphosphate kinase , PPK 偶联催化的 ATP 扩增反应结合生物发光检测法能够对微量微生物进行检测 。但是 PPK 当中结合的内源性的ADP 会产 生背景干扰 ,影响测定 。本文旨在融合表达ADK 和 PPK ,并建立一种方便有效的内源性ADP 的去除方法 ,降 低背景 ,使之与传统生物发光法结合 ,实现高灵敏生物发光法检测微量 ATP 及微生物 。【方法】PCR 扩增得 到 PPK、ADK 基因 ,插入表达载体 p ET28a ( + ) 中构建重组表达质粒 p ET28a ( + ) PPKADK ,表达 PPKADK 融 ( ) ( ) 合蛋白。利用表面包裹聚胺醇 Polyurethane 的磁珠 magnetic beads , 通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶 ( ) ( ) apyrase 固定于磁珠表面 ,制备固相腺苷酸双磷酸酶 Beadsapyrase ,用于除去与融合蛋 白结合的内源性 ADP ,降低 ATP 扩增反应的背景 ,从而使之与生物发光反应相结合 ,测定微量外源 ATP 及细菌菌落数 。【结 果】表达的融合蛋白具有 PPK 和 ADK 的活性 ,利用 Beadsapyrase 可以方便而有效的去除内源性 ADP ,显著地 降低反应背景 ,从而实现了利用 ATP 扩增反应与传统生物发光反应结合 ,测定了小于 1 fmol 的外源微量 ATP ,使生物发光法检测 ATP 及微生物的灵敏度提高至少 100 倍 。【结论】利用 Beadsapyrase 能够方便 、有效 地降低 PPKADK 中的ADP 背景 ,从而使 PPKADK 催化的ATP 扩增反应能够与传统生物发光法相结合 ,极大 地提高了生物发光法的灵敏度 。 关键词 : ATP 扩增反应 ;腺苷酸激酶 ;多聚磷酸盐激酶 ;生物发光检测 中图分类号 : Q933 　　文献标识码 :A 　　文章编号 (2009) 　　目前 ,利用生物发光法检测 ATP[ 1] 已应用于许 如图 1 所示 。1 分子的ATP 被 ADK 催化生成两分 多方面 ,尤其在食品卫生监控中 ,利用生物发光法进 子的ADP ,再通过 PPK 利用 polyP 将两分子 ADP 转 行微生物菌落计数已被认为是一种快速而有效的方 化成两分子 ATP ,两分子 ATP 可经过相同的反应生 法[2 ] 。但是传统的生物发光法不能检测低于 10-