外源性TNF-α基因克服多药耐药性的实验的研究.pdf

中国癌症研究进展。 外源性TNF．伍基因克服多药耐药性的实验研究 郭伟剑钱关祥吴国华沈兆忠郑颂国 罗建明胡亮孙欲晓 多药耐药性(MDR)是指肿瘤细胞对多种结构与功能不同的化疗药物产生耐药性。多种 原因之一，且由于凋亡抑制，产生MDR的癌细胞常对放射等其他疗法抵抗。克服MDR，提高 临床肿瘤的治疗效果有两条途径：①找寻能有效抑制或杀灭耐药细胞的药物或方法。②采用 MDR的逆转剂以恢复耐药细胞对化疗的敏感性。已发现多种化学药物体外具逆转MDR的 作用，但绝大多数因严重的毒副反应而无法应用于临床。肿瘤坏死因子．a(TNF-a)具多种生 物学效应，能直接抑制或杀灭多种肿瘤细胞，并能通过抑翻MDRl基因的机制逆转MDR[1]。 但其具有的严重广泛的毒性作用大大限制了它的临床应用。采用基因治疗的方法，将TNF-a 基因导人肿瘤细胞，使肿瘤局部高浓度持续表达TNF-a，局部发挥其生物学效应，则可望解决 这一问题。我们采用逆转录病毒介导腓a基因转染耐药细胞，观察田师k基因的导入对 耐药细胞的抑制及耐药性逆转作用，以期为TNF-a基因临床应用于克服耐药性打下基础。 材料与方法 1．细胞株与主要试剂 感型乳腺癌细胞株MCF7堋丌由上海市闸北区中心医院李杰博士惠赠，来源于美国NCI[2J。 包装细胞PA317为上海第二医科大学基因中心传代保存。细胞常规培养于含20％小牛血清 由上海第=医科大学基因中心与中科院上海生化所郑仲承教授共同制备，并克隆至pMEl8S。 ELISA 公司产品；TNF-a kit为晶美公司产品。ADR为浙江海门制药厂产品。 II 克隆至pBluescript 作者单位：200092上海，上海第二医科大学附属新华医院肿瘤放疗科(韩伟剑吴国华)；上海第二医科大学 人类基因治疗研究中心(钱关祥胡亮孙欲晓)；上海医科大学附属肿瘤医院分子生物学实验室(沈兆忠 郑颂国罗建明) 外豫性11吼基因克服多药耐药性的实验研究 349 滴度。 ’ 60％～70％时，加入含8 pg／ml的病毒上清，G418筛选获抗性克隆。同时设未感染细胞对照 组和空载体病毒感染对照组。收集细胞克隆，扩增培养细胞的病毒上清用于检测TNF-(t含 量。 4．TNF-ft含量检测采用Elisa法，按试剂盒说明书操作。 件参照文献[3]。 6．细胞生长曲线测定细胞接种于24孔板，每个样品设15个平行孔，每天取3孔台盼蓝 拒染法记数，作细胞生长衄线。计算细胞生长抑制率： 。 抑制率=麴盟器器器掣×100％ 103／孔，预培养24h后加入不同浓度的ADR，每组设空白对照孔，每个样本设3个平行孔。 继续培养68h后加人MTT液(4mg／m1)，再培养4h后离心弃上清，加入DIⅡ90(180止／孔) nin下读取吸光度，计算细胞生长抑制率：． 溶解沉淀，用酶标仅在波长570 抑制率=盥盟揣揣端产×100％ “多药效应软件”算出ADR对不同细胞的半数抑制剂量(IQo)，进一步计算耐药倍数与耐 药逆转倍数： 耐药倍数=蓑薹戮 耐药逆转倍散=旦萎墨嚣磊器器器{}幕笋 X 8．细胞内药物积累的分析调整细胞数为2105／ml，分别加入8 gmol／L浓度的ADR， 37℃温育3h、5h，收集细胞，冰PBS洗3遍，置冰浴中，半小时内上流式细胞仪检测，激发波长 为488 9．统计学处理结果以平均数±标准误表示。配对计量资料的t的检验比较两组的差 异，P0．05为有显著差异。， 结 果 1．戢体的构建及体外包装 所构建的含