包涵体蛋白复性的几种方法.pdfVIP

生物技术通报 · 技 术 与 方 法 · BIOTECHNoLOGY BULLETIN 2007年第 5期 包涵体蛋白复性的几种方法 罗惠霞 李敏 王玉炯 (宁夏大学生命科学学院，银川 750021) 摘 要： 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时，通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组 蛋 白，经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠，才能够得到生物活性蛋白。 关键词： 包涵体 复性 Refolding ofInclusion Body LuoHuixia LiMin WangYujong (Co／／egeofZfieScienceNingxiaUnivers ，Yinchuan750021) Abstract：WhenextrimicgeneshighlyexpressinEscherichiacoli，niclusionboay(inactiveproteniaggregation)will be formed．Inclusion body containsmuch epxression recombination proteir~Then protein with bioactivitywillbe got through separation，dena turation dissolution，andproperrefolding． Koywords： Inclusionbody Refolding 1 包涵体形成的原因 解 ；对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒 重组蛋 白在宿主系统 中高水平表达时。无论是 害的蛋 白时，包涵体形成无疑是最佳选择 。 用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表 2 包涵体的分离及溶解 达体系，都可形成包涵体 。事实上，内源性的蛋 白 包涵体是聚集的蛋 白质形成的非常致密的颗 质 ，如果表达水平过高，也会聚集形成包涵体 。因 粒，它们可直接用反相显微镜在活细胞 中观察到聊。 此 ，包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果 。 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集 动力学模型表 月日 【】：活性蛋 白的产率取决于蛋 白合 的重组菌细胞进行破碎 ，所采用 的破碎技术包括高 成的速率 、蛋 白折叠的速率和蛋 白聚集 的速率 。在 压匀浆 、超声波破碎等，为了提高破碎率 ，可以加入 高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋 白 一 定量的溶菌酶。包涵体高度抗剪切力 ，用以上破 正确折叠的速率就会导致包涵体 的形成 。实验证 碎法破碎后仍可保持完整的结构。离心除去破碎上 明。硫氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌 清液后 的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和 株 ADA494，ADA494(DE3)等有利于二硫键在细胞 盐酸胍、去垢剂如 ton)(100、脱氧胆酸钠等化合物 质内的形成2【】。重组蛋 白在大肠杆菌中表达时。缺乏 的缓冲液进行洗涤I41。包涵体的溶解一般都用强的 一 些蛋 白折叠过程中需要的酶和辅助因子 。如折叠 变性剂如脲 、盐酸胍或硫氰酸盐 ，或去垢剂如 SDS、 酶和分子伴侣等 ，是包涵体形成的又一原因。包涵 正十六烷基三 甲基铵氯化物、对于含有半胱氨酸的 体虽然由无活性的蛋 白组成 。但包涵体形成对于重 蛋 白质 。还需加人还原剂如巯基 乙醇、二硫赤藓糖 组蛋白的生产也提供了几个优势 ：包涵体具有高密 醇和半胱氨酸。温度一般选择在