苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白穿膜机理地研究方法.pdfVIP

植物保护科技创新与发展 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白穿膜机理的研究方法’ 刘妍风1’2向文胜1郭淑元3” (1东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030； 2中国农业科学院植物保护研究所，北京100193； 3北京理工大学生命科学学院，北京100081) 摘要：苏云金芽胞杆菌作为一种对人畜安全、无环境污染的微生物杀虫剂，在农、林 及卫生害虫的防治中发挥了重要的作用，成为国内外开发应用最成功的一种微生物农药。在 应用它的同时，各国科学家也纷纷深入研究杀虫晶体蛋白的杀虫机理。期望在明确其杀虫活 性机制的基础上，进一步改造蛋白分子，以提高对昆虫的毒杀作用，更好地为农业服务。近 年来，随着分子生物学，生物化学，生物物理学等实验技术手段的迅猛发展和学科间的不断 交叉，有关穿膜机制的研究方法和手段也越来越多，如基因的定点突变技术、蛋白的荧光标 记技术、原子力显微技术等，这些技术方法的应用为苏云金芽孢杆茵穿膜机理的研究提供了 有力的手段，使最终揭示杀虫机理成为可能。本文将对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白穿膜机 制研究中应用的主要研究方法进行综述。 关键词：苏云金芽胞杆菌；杀虫晶体蛋白；穿膜机制 苏云金芽胞杆菌(Bacillus 中归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。它形成芽胞的过程中，在 菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体(parasporalcrystal)。这 种伴胞晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，故又称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或8一 虫剂，在农、林及卫生害虫的防治中发挥了重要的作用，成为国内外开发应用最成功的一 种微生物农药口]。近年来，由于环境问题的恶化，Bt制品更被大力加以开发利用。大批 转基因植物的商业化，使得Bt转基因在生产中的地位迅速提高。因此，在加大应用Bt的 同时，各国科学家也纷纷深人研究杀虫晶体蛋白的杀虫机理，期望以此为基础进行蛋白的 理性设计和改造，进一步提高其对昆虫的毒杀作用，使这种杀虫蛋白有更好的应用前景。 当敏感昆虫摄食伴胞晶体后，伴胞晶体进入中肠，经过溶解和激活作用，释放出毒素 核心片段，然后作用于中肠上皮细胞，引起该细胞膨胀和裂解，最后导致昆虫肠道麻痹、 肠道穿孔或停止进食，直至虫体死亡。目前，一些种类的杀虫活性蛋白的三维结构已经成 功解析L4J，通过X光晶体衍射分析发现，完整的毒性肽一般由3个结构域组成，这些结 构在拓扑学上的相似性表明它们在杀虫机制上也有着相似性。结构域I是由7个d螺旋 ·基金项目：由973计划课题资助 作者简介：刘妍风(1983一)，女，硕士研究生，主要从事Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能的研究工作 ．．通讯作者：郭淑元，E-marl：guosy@bit．edu．cn 研究综述 束组成，其中d一5由其他6个螺旋围绕在中心。这个结构域被认为与蛋白的穿膜功能有 关J。结构域Ⅱ包括3个反平行B折叠片，这个结构域可能是与昆虫中肠受体结合的结 构域。结构域Ⅲ是由两个反向p折叠片组成的B三明治结构，其作用可能是增强毒素蛋 白的稳定性，防止昆虫肠道蛋白酶对毒素蛋白的进一步降解旧J。 对于Cry毒素杀虫机理，目前主要存在两种作用方式：一个是多年来人们认为毒素在 虫体内的顶端微绒毛细胞上形成孔洞，导致细胞渗透压失衡，虫体死亡【7I。最近也有人 提出毒素之所以能够起到杀虫作用，是因为毒素单体与Bt受体相互作用，激活PKA信号 通路，从而导致虫体死亡哺1。同时，对于普遍被接受的穿孔作用方式，人们提出了3种模 型假说。“刀状模型”认为，Cry晶体蛋白可成对地形成发夹结构作用于质膜，这样的螺 旋发夹结构形成的六聚体在质膜上形成一个亲水性的直径为0．6nm的孔一]。“伞状”模 型认为膜孑L的形成是通过形成多聚体，或第一结构区中其他螺旋的插入来完成的¨0|。“埋 龙模型”指出，蛋白的3个结构域都有插膜…J。 1 杀虫晶体蛋白穿膜机制研究所用方法 1．1 基因定点突变技术 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室 中改造优化基因常用的手段。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入， 可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了 解蛋白质结构和功能的关