肿瘤检测试剂的研究方法与技术.pdfVIP

肿瘤检测试剂的研究方法和技术 东南大学附属中大医院临床检验中心 吴国球 一概述 恶性肿瘤是当今威胁人类健康的最主要疾病之一，据2002年国际抗癌联盟预计，全世界癌症发病 人。肿瘤是失去了正常生物调控的异常生长和分化的细胞和组织。和其他疾病比较，肿瘤具有转移性 和早中期无临床症状两个明显的临床特征。为了达到早期发现、早期诊断、早期治疗的目的，学术界 对肿瘤标志物做了大量的研究。研究表明，肿瘤的生物化学改变早于临床表现，且早于物理仪器的发 现。肿瘤标志物的检测不需要昂贵仪器，使用试剂药盒测定简易、无创伤，可多次重复，既适于大样 本人群普查，又适用于肿瘤病人早期发现，肿瘤分期、预后判断和疗效监测，直至复发的预报。 肿瘤标志物(tumormarkers)是指特征性存在于恶性肿瘤细胞或南恶性肿瘤细胞异常产生的物质或 是宿主对肿瘤反应而产生的物质。这些物质存在于肿瘤绌胞和组织中，也可进人血液和其他体液，当 发生发展时，这些物质明显异常，标示肿瘤的存在。理想的肿瘤标志物应符合①敏感性高；②特异性 高；③浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度相关，有效治疗后很快下降；④存在于体液便于榆测。随着 肿瘤标志物在肿瘤诊治中的重要作用正为越来越多人认识，新的敏感、特异标志物的不断研究开发(如 基因标志物、端粒酶等)，目前已成为现代肿瘤学中发展最陕的一个重要分支。目前在临床常用的肿瘤 标志物有： 表1 常用肿瘤标志物 二肿瘤标志物的测定方法 肿瘤标志物主要采用生物化学比色法(酶类)和免疫柃测法。除了传统09．-大免疫学检测技术： 放射免疫分析(radioimmunoassy，RIA)，酶联免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)，荧光免疫分析 immunoassay，CLIA)，电化学 (fluoroimmunoassay，FIA)外，化学发光免疫分析(chemiluminescence fluoroimmunoassay，TRFIA)等技术已应用于各i级医院实验室。 三肿瘤标志物的发现和获得 2001年国内外科学家共同完成了人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)，绘出了人类基因 草图。人类肿瘤的发生往往与某一基因的结构与功能的改变，或者与其表达调控异常有关，如已经发 人类正常蛋白或宿主对肿瘤反应而产生某些物质，如果能分离这些异常蛋白就可以获得抗原，并对此 进行功能学研究。但有些肿瘤分泌的异常蛋白往往极其微量，通过生物材料分离制备这些蛋白是不可 dimension 想象的。目前国内外普遍采用二维电泳(2 eletrophoresis)的方法将肿瘤组织匀浆或体液中的 蛋白分离开来，与正常组织或体液的蛋白组分比较，就可以发现一些新的异常蛋白并获得这些蛋白。 通过N端15个氨基酸的测序可以获得相应氨基酸序列．然后利用i联密码子推导获得编码这些氨基酸 的核酸序列，设计引物，利用PCR技术(如锚定PCR)扩增获得目的基因。 如果肿瘤标志物已有研究，最快捷的力‘法是通过搜索查询GenBank(如NCBI)可以获得该标志物 的氨基酸序列和核酸序列，通过计算机软件辅助设计特异性引物，从肿瘤组织中提取总RNA，通过逆 转录酶(如M—Mulv)合成cDNA，最后用PCR扩增获得目的基因。 目的基因一旦获得，可以通过T／A克隆，或通过在引物中引入内切酶，插入相应载体(如pMD一18T)， 完成目的基因的克隆。同时，目的基因通过特异性内切酶切割并回收目的片段，与相同酶切的表达载 杆菌BL21)，通过诱导剂(如甲醇或乳糖或IPTG)诱导表达目的蛋白。最后用溶菌酶或超声破碎的力‘ 法裂解细胞，离子交换，凝胶过滤或亲和层析等方法纯化目的蛋白，用SDS／PAGE鉴定蛋白纯度。 四抗体的制备 大规模抗原获得后，可用传统的技术制备抗体：用抗原免疫新西兰白兔获得多抗，用杂交瘤技术 获得鼠源单抗。基因T程和噬菌体展示技术的出现，为抗体的制备提供了新途径。 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白的编码基因或基因片段插入噬菌体表面蛋白基因中，在阅渎框正 确且不影响表面蛋白正常功能条件下，使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。我 们可以将编码肿瘤标志物的DNA序列插入噬菌体展示载体中，使肿瘤标