大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定.pdfVIP

Research Papers PI目；3豢蓊器乞…缸s www．pibb．ac．cn 大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定 丁道芳1’ 邢三丽∞ 周呜呜1’ 宋后燕1’‘ (-)复旦大学分子医学教育部重点实验室，上海200032；≈复旦大学神经牛物国家重点实验室，上海200032) 摘要采用原代培养SD胎鼠神经干细胞，在形成神经球之后，传代至O．1％明胶包被的培养皿，显微镜下挑取一个神经球贴 壁后的细胞团，吹打后贴肇培养．同样方法挑细胞凼并传代培养5～6次，得到纯化的由一个神经干细胞扩增的克隆，对得 到的神经干细胞进彳J：鉴定以及分化能力的评估，证明得到的细胞就是神经干细胞．结果表明，成功分离J，SD胎鼠的神经干 细胞，进行单克隆化单层培养，神经干细胞和分化后的细胞标志基因都可以检测到．上述工作为疾病模型人鼠治疗及相关基 础研究提供细胞来源及形态标准． 关键词神经干细胞，单克隆化，Nestin，Sox2，GFAP，Tuff 学科分类号Q2-3 DOI：10．3724／SP．J．1206．2008．00330 神经干细胞在神经发育和神经损伤修复疾病中 干细胞的分化．本研究是旨次从胎鼠中分离得到神 发挥重要作用．一直以来，神经T细胞作为修复和 经干细胞进行单克隆化单层培养，在研究和实际应 代替受损脑组织的靶细胞来源，能有效改善疾病症 用方面来说，从胎鼠中分离得到的神经T细胞更具 状．除此之外，外源基冈转导至神经干细胞可用丁 有价值，同时本文也进一步说明不同来源的小同种 颅内肿瘤和其他神经疾病的基因治疗．神经T细胞 属的神经干细胞同样适用于贴壁单克隆化培养． 对于判断药效及药物毒性等也发挥很重要的作用， 1材料和方法 特别是对神经系统有毒性作用的药物，利用神经干 细胞培养技术可以观察到某些天然化合物和合成化 1．1试剂 合物的神经活性，为发展小分子治疗药物提供理论 基础． 神经干细胞通常以神经球的形式悬浮在无血清 的培养基中生长，彳日|此种方式有其缺陷性．旨先， 形成球体的时候，内部的细胞未能接触到培养基中 抑制分化的因子和营养成分，容易死亡和分化；其 Tuji购自Chemicon公司． 次，当研究某个基因功能的时候，无法观察此基因 1．2细胞培养 对细胞形态是否有影响，特别是促进分化和抑制分 取青春期SD大鼠一雌一雄合笼让其交配，次 化相关基因，无法观察细胞形态变化，也无法消除 日观察是否有白色的精栓形成，若有记为孕0．5d． 干扰因素；最后，形成神经球的细胞有时不是单个 至孕12d取胎鼠，脱臼处死，75％乙醇喷洒躯干 细胞增殖而来，所以对实验数据的可靠真实性有很 部位．腹部“T”形切口，拉出“Y”形的子宫， 大的影响．为此有必要对悬浮生长的神经干细胞球 可见胚胎成串珠样排列，子宫颈处剪断，置于 进行驯化贴壁生长．由于神经干细胞球贴壁后比较 10cm培养皿中，PBS反复冲洗去除血细胞．细胞 容易分化，所以必须进行单克隆单层化扩大培养， 操作台上，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，去除 并且对扩大培养的细胞进行鉴定． 胎盘和胞衣，在解剖镜下轻轻固定住胚胎，用眼科 目前所建立神经干细胞的单层单克隆化培养仅 ·通讯联系人． 有两篇报道【l，2】，分别为人和小鼠神经干细胞的单 Tel：1351219741 1，E-mai