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应用 UPLC-MS 进行血清代谢组学研究方法 卢建秋 （北京中医药大学科研实验中心,北京，100029） [摘要] 建立 UPLC-TOF-MS 的人血清非靶标代谢组学分析方法。UPLC-MS 仪器和方法学的进展和评估以便编 制标准操作规程（SOP ）用于 UPLC-TOF-MS 分析血清样本。建立了 UPLC-MS 分析方法用于高通量代谢组学研 究和用于研究健康受试者的血清代谢组学的 SOP，其它变量来源包括在 UPLC 柱上在同样的固定相不同的操 作批次和不同分析模块持续时间也将进行比较。 代谢组学与基因组学、转录组学和蛋白质组学在区分能力、处理量和费用相比，具有很多 优势。代谢组学是表现在生物系统中低分子量化合物的定量组成（定义为代谢物）特征，并 应用该数据来解答现实问题。研究包括确定微生物、植物、和哺乳动物系统与基因或环境修 饰和压力相关的的表性改变。代谢组学也是系统生物学研究中不可分割的组成部分。在代谢 组学流程中一般分为靶标分析和代谢轮廓图。代谢轮廓分析（代谢轮廓分析或非靶标分析） 在一个假设生成的策略中提供了一个整体的全貌的代谢物组图。通过有限的先前的关于哪个 代谢产物存在的知识，数千的代谢产物可以被检测到。检测的目的是无偏见的，虽然通过样 品前处理的方法和分析平台的选择具有一定程度偏见。在代谢轮廓分析中，一系列的分析平 台可以使用，LC-MS 和 NMR 是应用最广的。 1. 血清样品前处理 所有的血清样本均在 4℃下解冻，加入甲醇（血清：甲醇 1:3，室温）沉淀蛋白。涡旋 15s，离心 15min，15000g。上清液转移到新的EP 管，45℃冻干，16h （HETO VR MAXI 真空离 心干燥机，分析前存储在 4℃。样品经HPLC 级水（最初血清比例：水为 1:1）溶解，涡旋、 离心 15min，15000g。上清液转移到分析样品瓶中，存储在自动进样室4℃下，在 48h 内分析。 2.UPLC 柱测试混合样品 -1 为了评价 UPLC 柱的柱效，7 种代谢物的简单混合物（100μg ²mL 的尿苷、烟酸、色氨酸、 马尿酸、棉籽糖、苯丙氨酸和甘胆酸）溶于水配制而成。等份该溶液（200μL）冻干并按其 它样本同样方法进行处理。该 UPLC 柱测试混合样品首先进行分析，并在每个分析模块结束进 行分析，与所有检测样品的保留时间和峰高进行比较。 -1 常规设备维修包括从泵头和 UPLC 柱灌注 100%的乙腈最小值为 30min，流速 0.4mL ²min , 柱温 50℃.MS 源（样品锥孔和挡板部件）经超声处理清洁 50/40/10 甲醇/水/甲酸 15min。清 洗频率的变化见结果与讨论部分。 3.数据前处理 所有原始数据文件使用 Waters DataBridge 软件在 Windows PC.机上，均转为 NetCDF 格 式。免费 XCMS 软件用于转化每个 3-D 数据矩阵（强度³m/z ³时间-每个样品）转化成检测的 峰 VS 检测到的代谢产物峰响应的样品 ID，峰响应定义为超过一定质量和时间范围的窗口的 强度的总和。在 XCMS 中选择默认设置，除了S/N threshold (3), mass limit (0.1 amu), time limit(15 s), and sample limit (3)。以后的数据分析在Matlab (version 7.4)中进行。 4.结果与讨论 有许多实验变量和变异源可能影响代谢轮廓数据的重现性和有效性，而且可能限制数据 的生物关联性和适用性。这些参数的重要性在长期研究中充分表现出来。用于血清代谢组学 研究的一组优化 UPLC （反相水/甲醇梯度）和质谱仪参数均依赖于应用闭环多目标优化程序， 正如以前应用的 GC/MS 和广泛的 GC³GC/MS.这三个参数是检测峰数（高为佳），色谱分辨率 （高为佳）和分析时间（低为理想的）。这些参数被选为分离的区分特征和在确保足够的样本 207