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人乙醛脱氢酶（ALDH）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 预期应用 ELISA 法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中乙醛脱氢酶（ALDH）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中乙醛脱氢酶水平。用纯化的抗体包被微 孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙醛脱氢酶抗原、生物素化的抗人乙醛 脱氢酶抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶 的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙醛脱氢 酶呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板：一块（96 孔） 标准品（冻干品）：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释100 ng/ml， 50 ng/ml，25 ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml，样品稀释液直接作为 标准浓度0ng/ml，临用前15 分钟内配制。 如配制50 ng/ml 标准品：取0.5ml 100 ng/ml 的上述标准品加入含有0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 2.样品稀释液：1×20ml/瓶。 3.检测稀释液A：1×10ml/瓶。 4.检测稀释液B：1×10ml/瓶。 5.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100 稀释，稀释前根据预先计 算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul 检 测溶液A 加99ul 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 6.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100 稀释。稀释方法同检测溶 液A。 7.底物溶液：1×10ml/瓶。 8.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 9.终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1. 细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。 2. 血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 xg 离心20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 3. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8°C1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试 剂盒的检测范围。 1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标 准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120 分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A 工作液 100ul（取1ul 检测溶液A 加99ul 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。 3.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干 （也可轻拍将孔内液体拍干）。 4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A 工作液） 100ul，37℃，60 分钟。 5.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干 （也可轻拍将孔内液体拍干）。 6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4 孔 有明显的梯度兰色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止）。 7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与 底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8.用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。 在加终止液后15 分钟以内进 行检测。 注： 1.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。 测量时先用此孔调OD值至零。 2