洛伐他丁和膦胺霉素对烟草 HMGR 和 DXR 活性的影响.pdfVIP

4 2015．、0|．35．~／O：／．{)3 农 业 与 技 术 ※农、科学 洛伐他丁和膦胺霉素对烟草 HMGR和 DXR活性的影响 魏洁书 ，王 焕2，一，戴慧明4，卿志浩4，杨锦芬 2,3 (1．中山大学新华学院，广东 广州 510520；2．广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东 广州 510006 3．岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006；4．广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006) 摘 要：HMGR和 DXR分别是萜类生物合成途径——MvA和 MEP途径的2个关键酶 。本研究对烟草施用 HMGR和 DXR的专一抑 制剂洛伐他汀 (ME~)和膦胺霉素 (FSM)，测定烟草NtHMGR、NtDXR、 和GGPPS基因转录水平、HMGR和 DXR酶活性变 化。结果表明，抑制剂处理后烟草内源基因NtHMGR和NtDXR表达量在24h受到明显抑制；HMGR和 DXR活性均在一定时间内受 到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。 关键词：3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶 A还原酶 (HMGR)；1一去氧 一D一木酮糖 一5一磷酸还原异构酶 (DXR)；洛伐他汀；膦胺 霉素 中图分类号：TS411 文献标识码 ：A 植物萜类化合物的生物合成至少有 2条途径。细胞质 中 1．3 方 法 的甲羟戊酸途径 (mevalonatepathway，MVA途径)；质体中的 1．3．1 考察抑制剂喷施浓度和取样时间 2一甲基赤藓糖醇一4一磷酸途径 (2一C—mehtyl—D—erythri． MEV配制方法：取 25mgMEV，加入 0．5mL无水乙醇， 0【l一4一phosphatepathway，MEP途径)…。3一羟基 一3一甲基 55~C溶解，加入 2 正0．6mo~LNaOH，室温下放置 30min，用 戊二酰辅酶 A还原酶 (3一hydroxy一3一mehtyl~utarylcoenzyme HC1调节 DH至 7．5，加入纯水制成800tanol／L母液，稀释成 Areductase，HMGR)和 1一去氧 一D一木酮糖 一5一磷酸还原 30mol／L、50mol／L、75mol／L、 100tn(】L／L、200moWL、300mol／L、 异构酶 (1一deoxy—D—xylulose一5一phosphatereductoiso— 350mol／L、400mol／L。FSM配制方法：取 lOmgFSM溶于纯水， merase，DXR)分别是 MVA和MEP上游途径 中的2个关键 制 成 800tanol／L母 液，稀 释 成 75tnnol／L、 100ttmol／L、 酶 【，。 150tnnol／L、200／xmol／L。 洛伐他丁 (mevinolin，MEV)是 HMGR的专一抑制剂， 考察喷施浓度和取样时间：播种烟草种子，温室培养至 它能与HMGR的活性部位结合，竞争性抑制 3一羟基 一3一 三叶一心期 (苗龄约6周)，进行喷施。植株分为4组，分 甲基 戊 二 酰 辅 酶 A (HMG— CoA)转 变 成 甲羟 戊 酸 别喷施MEV、MEV溶剂对照、FSM、纯水对照，连喷3d，观 (MVA)【，；膦胺霉素 (fosmidomyein，FSM)是 DXR的专一 察植株生长情况 ，取致植株全部白化或变形的最低浓度为抑 抑制剂，它能阻断l一去氧木糖一5磷酸 (DXP)合成2一甲 制剂最适浓度。未处理烟草长至6个月，喷施最适浓度抑制 基赤藓糖醇 一4一磷酸 (MEP)[，。 剂 ，喷施前采样作为 0h样 品，喷施处理 6h、12h、24h、 36h、48h后各采集叶片 100rag，提取 RNA，荧光定量PCR检 1 材料与方法 测。引物见表 1，引物退火温度筛选、标准曲线建立方法参 1．1 材 料