3730测序(Sanger法)常见问题分析(汪大海).pdfVIP

3730测序常见问题分析 汪大海 深圳华大基因研究院 测序结果—峰图(整个序列) 测序结果—峰图(chromas) 四色图谱 每一种颜色对应的碱基 峰图分析常用软件 • ABI公司配套软件:Sequencing Analysis 5.2 • ABI公司免费软件:Sequence Scanner v1.0 • 较简单而直观的软件:chromas • 商业软件:DNAstar等 • …… Sequencing Analysis 5.2软件 峰图分析窗口 • 电泳图谱Electropherogram窗口 峰形是否正常/有无杂 带/信噪比/测序长度 Sequencing Analysis 5.2软件 Sequence窗口 • 原始数据raw窗口 平均信号高度/峰有无变宽/ 左右峰高是否均衡 信号值正常范围：150-1500 也可通过Sequence Scanner v1.0软件查看 怎样判别测序数据的质量? Sequence窗口 • Base QV for each base in each sample file Electropherogram窗口 • Base QV for each base in each sample file QV= -10 ×lgpe 上面公式中， Pe代表碱基读取的错 误概率 QV10 代表Pe=10% ； QV20 : Pe=1% ； QV30 : Pe=0.1% QV40 : Pe=0.01% 信噪比(Signal/Noise) S/N 3% Bkg. Noise 30 7.5% Bkg. Noise 13 12.5% Bkg. Noise 8 20% Bkg. Noise 5 影响测序质量的主要因素 • DNA模板（关键） • 引物 • 测序试剂 • PCR仪 • 纯化方法 预防的要点成功的关键 质粒测序 模板 : 引物= 200 ng : 3.2 pmol BigDye buffer终浓度保持1 × PCR产物测序 PCR产物测序前一定要经过纯化 PCR产物稀释后再测序 记住电泳鉴定判断有无杂带 案例分析 •引物问题 •模板问题 •纯化影响 •毛细管寿命与电泳 •困难模板 一、引物问题 ● 现象：每个峰后面有个