3分光光度计PPT.pptVIP

罗怕特-威廉-本生光谱分析法的发明者 1811年3月31日出生在德国哥廷根 ，他的发现用氢氧化铁作为砷中毒的解毒药的办法。 1859年本生和基尔霍夫研究加热的金属的放射光谱。完善了汽灯，发明了本生灯。此灯的温度可达230O°C，且没有颜色 吸收光谱曲线绘制 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，描出所有测量的点，用曲线连接 在坐标轴上标出 波长、吸光度以及单位 标出最大吸收峰处的波长及吸光度 在上方注明曲线的名称 “血红蛋白及其衍生物吸收光谱曲线” 在曲线旁边标注曲线对于的物质 把姓名序号标注在空白处 　　 光源： 可见和紫外分光光度计装有两种光源灯泡： 钨丝灯，产生可见光； 氢弧（氘）灯，产生紫外线。 由于玻璃吸收紫外线，所以氢弧灯的灯管多用石英制成，或在灯管上设有石英窗。 色散元件（棱镜或光栅） 单色器： 光狭缝 单色器的作用是将混合光分解（色散），并 可根据需要使一定波长的单色光投射至比色 槽。 比色杯： 形状大多为矩形。 比色杯的光径（溶液厚度）愈大，吸收的光能愈多，灵敏度愈高。 光电元件：光电管或光电倍增管 作用：将光能转变成电能。 光电管产生光电流的大小，与光强度和波长有关。 光电管对弱光的灵敏度大，光照过强或长时间曝光灵敏 度显著下降，即“疲劳” 现象。 温度对光电管的灵敏度有影响。 电子放大器 读数单元 读数元件 定量测定1、利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 标准曲线(浓度-吸光度曲线） 对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 0.2 0.8 0.4 0.6 A C ● ● ● ● ②对比法： 将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度： As = abCs； Ax = abCx Cx=Cs? Ax / As 由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品ab值相等，可用下式比较计算待测样品浓度： 主要内容 光谱分析法 1 分光光度计 2 实验步骤和要求 3 ??????????????????????????????????????????????????????? 722型分光光度计 722型分光光度计操作步骤 1、开机，打开盖板，预温30min； 2、将转换旋钮转至“T”，用“0”旋钮以“空白”调透光度至零； 3、盖上盖板，光路自动打开，用“100”旋钮调透光度至100%， 若不能调至100%，可调节灵敏度旋钮； 4、将转换旋钮转至“A”，此时吸光度A应为零，若非零，调节“消光零”旋钮至零； 5、拉动横杆，读取吸光度。 实验一 可见分光光度计波长校正 原理：镨铷玻璃是一种含有稀有金属镨和铷的玻璃制品，在可见光波长范围内，具有特征性的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作为校对仪器波长正确性的一个依据。 操作步骤： 用镨铷玻璃与空白光路作对照，每隔2nm，在529nm附近每隔1nm，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，测出波长从524nm～538nm的镨铷玻璃吸收吸光度，查找吸收峰的极值。 实验二 血红蛋白及衍生物吸收光谱测定 原理：血红蛋白在不同条件下可以形成不同的衍生物，如血红蛋白溶液在空气中与氧气充分接触可形成氧合血红蛋白HbO2 ，与一氧化碳反应则会合成碳氧血红蛋白HbCO ，高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白（MHb）。 HbO2 HbCO 组成成分不同 分子结构不同 MHb 特有吸收光谱 操作步骤： 1. 样品的制备 5 ml H2O + Hb (2滴) 5 ml H2O + Hb (2滴)+ 铁氰化钾（1滴）