实验理论 分光光度法.pptVIP

南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 如何鉴定溶液的浓度？ 分光光度法的原理 Lambert-Beer定律（光吸收定律） 溶液的质量浓度（C）越大，液层厚度（L）越厚，则溶液对光线吸收得越多。 当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即K吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度成正比。 所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。 分光光度法 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：分光光度法灵敏度高、精确度高、操作简便、快速，对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分。 分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中200～1000nm为一段波长的光谱。 紫外光区200～400nm 可见光区400～760nm 红外光区760～1000nm 分光光度法的应用 用标准管法计算待测液浓度 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），及未知浓度（CU）溶液的吸光度（AU），根据定律得：  AU=KUCULU ； AS=KSCSLS 因为KU=KS， LU=LS 所以AS与AU之比值也等于两浓度之比值  即 AU/AS=CU/CS ， CU= 分光光度法的应用 用标准曲线法求出待测溶液的浓度 先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按测定管同样操作方法处理显色，分别读取各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。 分光光度计的基本结构 V-1100分光光度计 V-1100分光光度计操作步骤 开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到T档 将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖，按 键切换到A档 拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校零 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A 读数后，将黑体推入光路中，开盖取出比色杯 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并晾干 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。 分光光度计使用的注意事项 试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。 拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。 比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。 比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 盛液时不能太满（约达比色杯2/3体积），外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。 * 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 分光光度法 入射光 I0 出射光 It 反射光 Ir Ia 吸收光 It／I0 ＝ T T （ transmittance ）称为透光度 ，表示透过光的强度是入射光强度的百分比。 A∝C 光密度与浓度成正比 T与C成反比，浓度愈大，T愈小 A= - Ig = KCL T A （Absorbance）称为吸光度，指溶液对光线的吸收程度又称为光密度（Optical density， OD ）。 AU AS ×CS 吸光度A 蛋白质浓度C（μg/ml） 0.2 0.4 0.6 . . . . 40 80 120 160 光源 单色 光器 吸收池 测光 机构 钨丝灯 氢灯 氘灯 棱镜 衍射光栅 玻璃比色杯 石英比色杯 硒光电池 光电管 光电倍增管 将光能转变为电能，光电流的强弱与溶液的吸光量强弱有关。 MODE 0% MODE 100% * 生物化学与分子生物学实验教学中心