麻疯树脱氢抗坏血酸还原酶基因克隆及重组蛋白纯化.pdfVIP

2014年 9月 四川大学学报 (自然科学版) Sep． 2014 第 51卷 第 5期 JournalofSichuanUniversity (NaturalScienceEdition) Vo1．51 NO．5 doi：103969／j．issn．0490—6756．2014．05．037 麻疯树脱氢抗坏血酸还原酶基因克隆及 重组蛋 白纯化 唐 佳 ，喻 川 ，韩海洋，严 君，魏 炜 (四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育重点实验室，四川省生物资源与生物制药重点实验室，成都 610064) 摘 要：利用 RACE技术克隆出麻疯树脱氢抗坏血酸基 因JcDHAR，构建原核表达栽体 pET一28a～JcDHAR，并对重组茵表达的条件进行 了优化 ，进而进行 Ni亲和层析纯化蛋白．结 果表明：表达产物与预期大小相符 ，His—JcDHAR蛋 白质的分子质量为30kD；在 37℃的条 件下0．1mM 的IPTG诱导表达 5h时，获得 了可溶性重组蛋 白 通过体外酶学反应鉴定，纯 化样品具有酶学活性，表明JcDHAR原核表达成功． 关键词：脱氢抗坏血酸还原酶 ；原核表达 ；蛋 白纯化 ；麻疯树 中图分类号：Q78 文献标识码 ：A 文章编号 ：0490—6756(2014)05—1085—07 ProkaryoticexpressionoptimizationandproteinpurificationofJatropha curcasdehydroascorbatereductasegene (JcDHAR) TANGJia， Chuan，HAN Hai—Yang，YAN Jun，WEIWei (Key laboratoryofBio-resourcesandEco—environmentofM inistryofEducationC ollegeofLifeScience，SichuanUniversity，Chengdu610064，China) Abstract：TheDHAR geneofJatrophacurcaswasclonedbyRACEtechnique．wasconstructedThepro— karyoticexpressionvectorpET一28a—JcDHAR andinducedtoexpressin0．1raM IPTG and37℃ for5 hourstoobtainasolubleprotein，themolecularweightofexpressionproductwas23．5kD．Thenpurl— fiedtheHis—JcDHAR proteinbyNiaffinitychromatography．Thepurifiedtargetproteinwasidentified byenzymaticreactionsin vitro，suggesting thatthesamplehad theenzymeactivityandindicating the SuccessofJcDHAR prokaryoticexpression． Keywords：JcDHAR；Prokaryoticexpression；Proteinpurification；Jatrophacurccls 长_1]．在植物体内，活性氧 (ROS)的产生通常与 引 多种环境胁迫密切相关 ，而抗坏血酸 (Asc)则是植 植物时刻都面临着来 自不断变化 的自然环境 物体 内含量最为丰富的抗氧化剂，是保护植物免 压力 ，尽管大多数植物不能像动物一样通过移动 受氧化破坏的主要贡献者，它在植物清除 ROS的 方式来避开不 良环境 的影响，但是植物具有各种 过程中，会因失去质子而被氧化．在植物体内有 抵抗不