HPLC法测定Mucor sp.产肉桂酸降解酶的活性和动力学分析.pdfVIP

囝分析测i式 WWW．hxyswgc．com2015，VoI．32No．03亿Ch亏白佳物互程 em istry Bioengineering HPLC法测定Mucorsp．产 肉桂酸降解酶的 活性和动力学分析 莫风萍 ，马 丽。刘雄民 (广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004) 摘 要 ：建立 了高效液相色谱法测定 肉桂酸 降解酶活性 的方法。以肉桂酸为底物 、苯 乙酮为探针 ，通过测定苯 乙酮 的生成速率来计算酶活并进行酶催化动力学分析 。色谱柱为 HypersilODS2柱 (250mm ×4．6mm，5 m)。柱温为 3O ℃ ．流动相为 乙腈 ：水 ；冰 乙酸=50：50：0．5(体积 比)，流速为 1．0mL ·rain_。，检测 波长为 247nm。苯 乙酮的线性范 围为 1．952～156．2 g·mL_。．回收率为 99．46 ～101．2 ．RSD≤1 ，检 出限为 o．45／z．g ·mL (S／N=3)。结果表 明，该方法稳定可靠 ，简便 ，重复性好 ，不受杂质干扰 ，可用于 肉桂酸 降解酶的活性测定和动力学分析 。粗酶液和不同浓 度的肉桂酸在 3O℃下反应 2h后，HPLC法测定初反应速率，以双倒数作 图法计算酶动力学参数．双倒数 图呈直线，符 合米 氏方程规律 ．米 氏常数 K 一0．07g·L_。，即0．473,umol·L- ，V… =0．058~／mol·rain ·mg_。。 关键词 ：HPLC；酶活；肉桂酸 ；苯 乙酮 ；动力学分析 中图分类号：0657．72 文献标识码 ：A 文章编号：1672—5425(2015)03—0062—04 天然的香精香料是高附加值的食品添加剂和精细 1 实验 化工产品，利用生物催化转化天然前体是一种获得天 然香精香料的有效途径 ，目前 已成为 国内外的研究热 1．1 菌株、试剂与仪器 点口]。肉桂酸是广西特色林产资源 ，是桂油生产过程 毛霉菌Mucorsp．，自行保存。 中的副产物[2]，本课题组在前期研究中首次筛选到的 乙腈 ，色谱纯 ，Merck公司；肉桂酸和苯乙酮标准 菌株 Mucorsp．能将肉桂酸转化为高附加值 的天然香 品，分析纯 ，国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均 料苯 乙酮 ]。前期的研究重点主要集 中在发酵工艺 为分析纯 。 的优化 ，对催化该反应的相关酶 的酶学性质 尚未开展 LC一2OAT 型泵 ；SPD-10A 型 UV—Vis检测器 ，日 研究。微生物细胞催化作用 的实质是酶促反应 ，酶活 本 Shimadzu公司。 力 (酶活)是衡量酶生物活性及含量的重要指标L6]，因 1．2 标准溶液的配制 此 ，建立适用于肉桂酸降解酶酶活检测方法 ，为进一步 准确称取苯乙酮标准品适量 ，以乙醇为溶剂 ，配制 开展肉桂酸降解酶酶学性质和催化机理研究奠定分析 成 0．3904g·L 的标准溶液，4℃储存 ，备用。 基础 ，是十分迫切和必要 的。 1．3 样 品处理 目前 ，用于测定酶活的方法主要有 比色法、滴定 1．3．1 粗酶液的制备 法 、紫外分 光光 度法 、酶 偶联 法 、高效 液 相 色谱 将菌株接种于 200mL液体培养基 中，按一定 的 (HPLC)法[6-a]，其中高效液相色谱法 由于具有灵敏度 培养条件进行培养 ，得到发酵液 ，再将发酵液离心，上 高、稳 定性好 、抗干扰 性强等 优 点而得 到广泛应 清液即为粗酶液。 用 ，适用于酶催化动力学分析n