地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测.pdfVIP

第28卷第4期 华中农业大学学报 V01．28No．4 2009年8月 JournalofHuazhongAgricuhuralUniversity Aug．2009，459～462 地高辛标记的DNA探针制备及其 应用于溶藻弧菌的检测★ 周凤丽 简纪常一 吴灶和 (广东海洋大学水产学院／广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省 教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江524025) 摘要 从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列，根据基因的保守性用 DNAStar分别设计2对引物，分别对溶藻弧菌基冈组进行PCR扩增，用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制 备探针。分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧 菌进行斑点杂交检测，检测结果表明，胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产 生较强的阳性反应，而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应，表明该胶原蛋白酶DNA探针的 特异性较强；而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应，但与 哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应。与霍乱弧菌DNA则无反应，表明该外膜蛋白DNA探 针的特异性较低。说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强．简便易行，可 应用于溶藻弧菌的快速检测。 关键词溶藻弧菌；胶原蛋白酶DNA探针；外膜蛋白DNA探针；斑点杂交 939．1 中图法分类号Q 文献标识码A 文章编号1000-2421(2009)04-0459—04 据报道，弧菌能感染并导致48种海水鱼发记制备成探针，用斑点杂交的方法对不同来源的溶 藻弧菌进行检测，建立了溶藻弧菌的快速检测技术， 病[1|，主要致病弧菌为溶藻弧菌(Vibrioalginolyti- f“s)、副溶血弧菌(V．parahaemolyticus)、哈维氏现报道如下。 弧菌(V．harveyi)、鳗弧菌(V．anguillarum)、拟 1材料与方法 态弧菌(V．mimicus)等10多种弧菌可以引起鱼 类病害L21]，甚至会导致人或其他动物发病[8。9]。1．1材料 为了对鱼类弧菌病进行有效地监控、诊断和防 试验菌株：溶藻弧菌阳性株、霍乱弧菌(阴性对 治，建立灵敏、准确、快速的病原检测技术已是迫 照)、哈氏弧菌(阴性对照)和副溶血弧菌(阴性对照) 在眉睫。 均为笔者所在实验室保种的菌株；其它溶藻弧菌菌 目前，PCR和标准的经典方法作为微生物检测株为笔者所在实验室自广东省湛江市特呈岛和麻斜 的常规方法已得到较广泛的应用，但也存在着其缺 地区不同鱼排取样分离。 点，如PCR法假阳性高，标准的经典方法历时长。1．2方法 而斑点杂交通过生物素、地高辛等小分子标记的特 1)DNA模板的提取。溶藻弧菌DNA的提取 异性DNA片段与病原的靶DNA片段杂交进行检按文献Ei03的酚氯仿法。副溶血弧菌、哈氏弧菌及 测，具有快速、准确、简便易行的优点。因此，笔者根 霍乱弧菌DNA提取参照煮沸法进行[11]。 据溶藻弧菌GenBank发表的2个特殊的毒力基因2)特异阶认片段的扩增及纯化。从基因库中 即胶原蛋白酶基因和外膜蛋白基因保守序列设计引 获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基 物进行扩增，并将扩增出的基因序列应用地高辛标 因序列，根据基因的保守性用DNAStar分别设计2 收稿日期：2008-04—30；修回日期：2009—01—27 **通讯作者．E-mail：jianjc@grnail．c-30m 周凤丽，女．1981年生，广东海洋大学水产学院硕士研究生，湛江524025．E-mall：kellyzhoul981@163．corfl 万方数据 460