鲤春病快速诊断技术的临床应用.pdfVIP

维普资讯 INSPECTIONANDQUARANTINESCIENCE检验检疫科学 Vo1．18No．3 2008年第 3期 口应用技术口 鲤春病快速诊断技术的临床应用 张利峰 王 姝 段向英 高隆英 邴国霞 江育林 夏 春 (1．中国农业大学，动物医学院，北京，100094；2．北京出入境检验检疫局，北京，100026；3．深圳出入境检验检疫局，深圳， 518000；4．北京市水产技术推广站，北京，100021) 摘 要：本文在建立的鲤春病病毒荧光RTP·CR快速检测技术基础上，对国内外收集的19株SVCV病毒悬液 进行了验证试验，验证结果良好。另外，还通过人工动物感染试验，将感染SVC病毒的鲤鱼组织样品在同经典的细 胞培养分离病毒方法对比研究后，认为应用该方法检测SVCV的组织研磨样品悬液时，最多能将 3尾鱼的组织器官 混合后制备待检样品。本文还用本实验室制备的SVCV单抗，运用间接免疫荧光抗体技术 (IFAT)对SVCV欧洲株 和亚洲株感染的鲤鱼上皮瘤细胞进行检测，结果表明，该抗体可特异性检出接毒后感染细胞中的SVCV欧洲株和亚 洲株，表明应用该单抗可以检测出SVCV的欧洲株或亚洲株，不会造成漏检现象。 关键词：鲤春病毒；荧光RT-PCR；单克隆抗体；间接免疫荧光抗体技术 中图分类号：$941．41+6；Q5O3 1前言 2．1．3细胞生物学主要试剂 ：199细胞培养液 (Earle、s 鲤春季病毒血症 (简称鲤春病 ，SpringViremiaof 平衡盐)、弗氏佐剂 (Sigma公司产品)，DMEM高糖 Carp，SVC)是一种由弹状病毒科水泡病毒属的鲤春病 培养基、HAT、HT (GibcoBRL公司产品)，PEG4000 毒血症病毒 (SVCV)引起的，能感染四大家鱼和其他 (MERCK公司产品)，胎牛血清 (Hyclone公司产品)、 几种鲤科鱼并导致鱼死亡的疫病，是一种急性出血性 FITC标记羊抗鼠IgG(购 自中山金桥生物公司)，羊抗 高度传染性病毒病 。常在鲤科鱼特别是在鲤鱼中流 鼠IgG亚类 (SouthernBioteeh公司产品)。 行 ，该病通常于春季暴发并引起幼鱼和成鱼死亡 。 2．1．4 分子生物学主要试剂 ：Ready—To—G0RT—PCR 1971年，欧洲人首先报道了鲤春病，该病广泛流行于欧 Beads(AmershamBiosciences公司产品)；Tag酶 ；裂 洲各国及部分其它国家，是世界动物卫生组织 (OIE) 解液 (TRIZOLS)、氯仿、异丙醇 (一20℃预冷)、75％ 规定的需要向OIE申报的疫病之一 ，也是 中华人民 乙醇 (用 DNase、RNaesFree水配制 ，一20℃预冷)、 共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录 中 DNAMarkerDL2，000(宝生物公司产品)、LightCycler 的二类疫病，属于需要严格控制的疫病。 (Roche公司产品)。 目前国际上 尚无 SVCV的荧光 RT—PCR快速检测 2．2方法 方法，而传统的细胞培养分离病毒的方法一般都需要 2。2．1鲤春病病毒靶 区域的选择以及引物和探针的设计 15d以上才能出结果 ，检测周期太长 不适应 口岸快 选择鲤春病病毒G基因核苷酸序列 ，设计合成多 速检疫和大通关的时代要求 ，我们建立的只需4h就 条引物和探针，进行配对筛选。 可以出结果的荧光RT—PCR检测鲤春病毒的方法不仅 2．2．2荧光 RT-PCR检测鲤春病毒反应体 系的优化[】 具有检测周期短的优点，而且具有操作简便 ，自动化 (1)引物和探针浓度的优化 (2)镁离子浓度、Taq 程度高，适合于 口岸快速标准化检验检疫的需要。