细胞工程实验-植物愈伤组织诱导实验.docVIP

实验二 植物愈伤组织诱导实验 一、实验目的 掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。 二、实验原理 植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备，其工作原理为：室内空气→预过滤器（初滤）→小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器（精滤）→出风面吹出洁净气流（具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境 三、主要仪器与试剂 1.实验仪器：培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、试剂瓶、不锈钢浅盘、酒精灯、记号笔 2.实验材料与试剂：10%次氯酸钠、已配置好的MS培养基、70%酒精、已准备好的无菌水、胡萝卜 四、实验步骤 1.用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。 2.将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。 3.将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。 4.弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。 5.弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。 6.将已灭菌的胡萝卜置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。 7.将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。 8.在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。 9.将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下，20天左右外植体逐渐膨大形成愈伤组织，愈伤组织的形成标志着接种的外植体已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。 五、实验结果 进行实验1周后，所培养的5个组织块有4块形成愈伤组织，其中有2块生长较为旺盛，还有一块组织块被污染。（如下图所示）。3周后，组织块全部被污染，生长停止。 六、思考题 1. 以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他现象。并简述本人的培养结果或现象。 本组出愈率为57%，污染率为100%。我的培养瓶中，有4块组织块形成愈伤组织，1块被污染，后期污染扩散，组织块全部被污染。 2.你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意哪些事项？ 严格的无菌操作可以避免培养过程中组织块受到污染，从而保证组织块的出愈率以及后期的培养过程，从而直接影响到实验的成功与否。 在具体操作时应注意以下几点： 在进行实验前要用酒精棉球对桌面以及进入工作台部分的手及手臂进行全面的消毒。 实验器具在使用前要用酒精棉球擦拭并在酒精灯上灼烧。 实验全程在酒精灯旁进行，尽量不要离开工作台。 放置好组织块并扭紧培养瓶瓶盖前要将瓶口及瓶盖在酒精灯上灼烧一下。 1