2013浙科版选修1第四部.分《实验十三 DNA片段的PCR扩增》word教案.doc

DNA片段的扩增——PCR技术 ? 【教学目标】 （一）认知目标 1、了解PCR技术的基本操作步骤。 2、理解PCR的原理。 3、讨论PCR技术在生产生活中的应用。 （二）能力目标 1、通过多聚酶链式反应扩增DNA片段，锻炼学生实际动手能力。 2、通过严格控制温度等反应条件，培养周密的思维能力。 （三）情感、态度与价值观目标 1、 通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神。 2、 通过对生物高新技术的接触，加深学生对实验科学的热爱。 【课题重点】 PCR的原理和PCR的基本操作。 【课题难点】 PCR的原理 【教学方法】 启发式教学 【教学工具】 多媒体课件 【教学过程】 （一）引入新课 上课之初先在视频上播放一段中央12套《天网》节目，截取其中法医提取毛发，提取DNA进行与嫌疑人比对的片段。（从学生熟悉的节目场景入手，激发他们心中疑惑已久的探知兴趣）。 师：法医提取的毛发里面的DNA量是比较少的，要进行比对需要大量的DNA样品，也就是在比对之间是不是需要先对DNA进行扩增？这就是咱们今天要学习的科技尖端的PCR技术，即：聚合酶链式反应，简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）。等学完本课你们要告诉我PCR技术还能应用与什么领域？ （二）新课教学 1．基础知识 PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似： 1．1细胞内DNA复制条件分析：（引导学生思考需要的条件，师生共同完成下表） 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打开DNA双螺旋 催化合成DNA子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 1．2 简单复习DNA复制过程 解??? 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。 引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。 DNA聚合酶结合。 子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。 1.3? DNA分子复制的人工控制 ?? 根据DNA复制的条件，我们能不能在体外模仿DNA的复制，进行体外扩增呢？教师引导学生归纳DNA体外扩增需要的条件： 解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 思考：为何不需要解旋酶？在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC—95 oC，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶。 恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。 思考：引物的作用是什么？ DNA 的复制都需要引物，在体内复制时，先由RNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA3’端开始合成新的DNA链，产物片段的长度严格地限定在两个引 物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。（根据PCR原理图示帮助理解） 反应场所：PCR仪。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？ ? 4．PCR的反应过程 变性 复性 延伸 ? ? 变性：在95℃时DNA解旋 复性：在50℃时引物与DNA单链结合 延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列） 思考：为什么延伸温度为72℃？ Taq酶在72℃左右才有最佳的活性。 思考：一般进行多少个循环？共有多少条PCR产物？ 25-30个循环最佳，过少产物量不够，过多原料、能量等消耗殆尽。产物为225-230。 展示PCR原理示意图，梳理清晰： ? 2．实验操作 2.1 ?PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水 2.2 ?实验操作步骤 2.3 ?按照PCR反应体系配方配制反应液； （2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （3）将微量离心管放到PCR仪中； （4）设置PCR仪的工作参数。 （5）DNA在PCR仪中大量扩增。 3．实验注意事项 3.1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 3.2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。 3.3每添加一种反应成分，更换一个移液