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锦鲤保护性组织 RNA 提取及引物扩增研究 ﹡ 王亚军，吴立山，洪松柏，刘必谦 宁波大学“应用海洋生物技术”教育部重点实验室-海洋生物工程省重点实验室，浙江宁波 （315211） E-mail ：wangyajun@ 摘 要：品质优良的锦鲤个体十分珍贵，分子生物学研究中，在不杀死、不伤害锦鲤个体的 情况下，获取完整的组织细胞RNA，十分关键。对锦鲤。取鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液， 利用 TRizol 法提取 RNA。结果表明，从以上各种组织提取到的 RNA 质量高，特异性引物扩 增效果好，可以满足进一步分子生物学研究的需要。 关键词：锦鲤；保护性组织； RNA提取；引物扩增 1．引言 锦鲤是淡水养殖观赏鱼中的精品，被称为水中宝石，经过长期的人工选育，已经形成了 众多花色、品系，每年国内外都举行多种比赛，体色、体形具佳的个体价格昂贵。随着观赏、 养殖的不断发展，国内外锦鲤研究项目呈不断上升趋势。在锦鲤体形、体色及生长等方面的 研究中，基于分子生物学的研究必须用到 DNA ，RNA 样品[1]，相关报道中养殖个体的取样 以鱼体的肌肉、肝脏、脑等组织为主，这些组织的取样或要杀死个体，或会对养殖锦鲤造成 致命性的伤害，极易造成个体感染死亡[2,3] 。对于价格昂贵的珍稀个体，就无法用作取样对 象，但这些个体往往又是研究的极佳材料。如何获得各方面都能满足实验要求的RNA 样品， 又尽量少伤害被取样个体，使其不发生致死或感染，成为高品质锦鲤个体分子生物学研究的 出发点。本研究重点研究了用鳍条、鳞片、腮丝、血液等四种组织提取RNA，并且利用获得 的RNA 进行逆转录反应及相关基因的引物扩增。 RNA 提取最大的困难是 RNA 容易降解，外源性和内源性的 RNA 酶污染很难控制，在 整个提取分离的过程中有很多方法可以运用，常用的如异硫氰酸胍/氯化铯法、硫氰酸胍/ 热酚法、氯化胍法、氯化锂/异硫氰酸胍法，以及现在使用较多的 TRizol 法，各种方法都有 一定的特点、优势。本研究以锦鲤鳍条、鳞片、腮丝、血液为材料，采用 TRizol 法提取 RNA， 得到了较高质量的 RNA ，并用相关基因的引物进行了 RT-PCR 扩增，得到了较为满意的结 果。取样个体的活力、健康性不受影响。 2. 材料与方法 2.1 材料 实验用锦鲤取自宁波大学海洋生物工程重点实验室养殖基地，为红白双色个体，体长 40cm ,体重2.5kg。用撒网从池中捕出，尾静脉取血，其余组织样品经过 PBS 清洗放入1.5ml 离心管中，液氮冻存运输回实验室，-80℃超低温冰箱冻存。 2.2 实验器皿的处理 玻璃器皿、剪刀、镊子等清洗干净后在 200℃烘烤 8h。离心管，移液枪头用 0.1%的DEPC (焦碳酸二乙酯)溶液浸泡过夜,并在 121℃高压灭菌 30min 以除去DEPC,100 ℃烘干备用。 - 1 - 2.3 试剂 ①磷酸盐缓冲溶液( PBS) : 1.15 g 磷酸氢二钠, 012 g 磷酸二氢钾, 8 g 氯化钠,012 g 氯化钾, pH 7;②TRizol （invitrogen 产品）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC 处理水③M-MLV 逆转 录酶、Oligo dT18 反转录扩增体系④β-actin 引物，热激蛋白 hsp90 引物，PCR 扩增体系⑤ 琼脂糖、10×凝胶加样缓冲液。以上溶液均用 0.1%DEPC 水配置，灭菌处理。 2.4 方法 ①取样：1.血液：取 2ul 血细胞 2. 用处理过的剪刀、镊子取鳃、鳍、鳞 30mg 左右组织， 迅速将各组织剪碎。 ②在 1.5ml 离心管中加入 300ul TRizol,加入各组织，