反相HPLC测定尿样蝶呤物质研究.pdfVIP

LC．001 反相HPLC测定尿样蝶呤物质的研究 孟英韬宋力 单忠敏徐凤铎 (天津儿童医院儿研所生化室天津300074) 1前言 蝶呤物质都含有蝶啶环，随着6，7位上取代基的不同，有不同的名称，主要有新蝶 呤、生物蝶呤、蝶呤等。近年发现几种主要蝶呤物质在人体中的变化与机体病理状态之间 存在联系，如新蝶呤是细胞免疫功能活化指标，6．羟甲蝶呤与恶性肿瘤可能有关，生物蝶 呤与新蝶呤之比可用于苯丙酮尿症与四氢生物蝶呤缺乏症的鉴别诊断等…。因此建立准确 测定体液中蝶呤物质的方法对深入研究蝶呤物质与疾病间的关系具有重要意义。蝶呤物质 由于难溶于水，在体内含量低，见光易分解，彼此间化学性质接近而难用常规方法分离定 量。高效液相法测定蝶呤类物质是最适宜的方法，但只能用荧光检测器测定…。国内文献 对蝶呤物质测定的临床意义已见诸报道．只是在方法学研究上所提甚少，难以推广…。本 文参照文献采用的是反相|玎，Lc测总新蝶呤及生物蝶呤的方法，以酸性碘，碘化钾氧化还 原型新蝶呤及生物蝶呤，甲醇水为流动相。对尿样蝶呤物质的测定进行了方法学的实验， 适用于临床应用。 2方法 所用HPLC由SP8800三元梯度泵及FL2000荧光检测器(美国光谱物理公司)组成， 用中国科学院大连化学物理研究所编写的DL800色谱工作站进行图谱记录和数据处理． 5 柱子为ODSum 5mol，L的NaOH 呤、蝶呤，6掘甲蝶呤，6-甲基蝶呤均购自sigma公司。标准品先用少量0．o 溶解，再用蒸馏水稀释，4℃避光保存。碘腆化钾溶液：碘与碘化钾以l：2比例混合，·加 少量0．1mo儿盐酸溶解，再用o．1mol，L盐酸稀释至碘的质量浓度为lO玑。尿样加等体 积碘腆化钾溶液，室温避光反应1h，滴加抗坏血酸(1009几)至棕色消失，以6一甲基蝶呤 作内标，用0．45 um微孔滤膜过滤，滤液进样量为lO uL。所有操作均在暗光下进行。 3结果 标准品分离图谱：见图l和图2。 蝶呤及6-羟甲蝶呤在此条件下虽也出峰，但分离不完全，未进行定量计算。 线性范围与最小检出限见表l。 表1线性范围与最小检出限 奇曲 最小检出限(pg几) 线性范围 线性回归方程 相关系数 自仲 信，噪_2：l (pg几) 爿为峰面积。y(ug几) r 新蝶呤 26．1 26．1～1670 卜5．59x o．9995 lo—静13，67 261 26．1～1670 o．9993 生物蝶呤 y斗44×1dt聃14．82l 6．甲基蝶呤 4l71 41．71．2670 o．9997 净2．3I×lo●舟23．792 批内变异系数：新蝶岭，生物蝶呤和6-甲基蝶呤3种标准品混合液连续进样5次 ．23． 以峰面积计算，C肛(3．1“．0)％。若以峰高计算，变异系数c肛(2．8~4．5)％。批间变异系 数：新蝶呤为9．4％，生物蝶岭为64％，6．甲基蝶呤为9．4％(=4)。回收率：往已知浓度 的标准品混合液中加入不同浓度的新蝶呤、生物蝶呤和6．甲肆：蝶呤，结果新蝶呤、生物 蝶呤、6．甲基蝶呤平均回收率在85％一104％之间。标本保存时间：尿样4℃或．20℃下保存 10d，蝶岭测定值平均下降17％。正常值：1岁“岁健康儿童46人，尿样中蝶呤类物质 的含量分别为：新蝶呤，尿肌酐163~475n∥mg；生物蝶呤，尿肌酐238～504n∥mg；新蝶呤， 生物蝶呤在O．48～1．35ng，mg之间。由于尿肌