NSE启动子调控的pNSE-IRES2-EGFP-p27双顺反子真核表达载体的构建及表达分析.pdfVIP

维普资讯 382 ChineseJournalofRehab|1itation。December2007，Vo1．22No．6 NSE启动子调控的pNSE—IRES2一EGFP—p27双顺反子 真核表达载体的构建及表达分析* 朱舟，陈华先，徐逸，张强，陈晨，王伟 (华中科技大学同济医学院附属同济医院神经 内科，武汉 430030) 【摘要】 目的：构建并鉴定带 NSE启动子的 Flag—p27和 EGFP双顺反子真核表达载体 pNSE-IRES2一EGFP-p27，转 染原代培养 的神经元 ，观察其表达 。方法 ：通过质粒抽提 。电泳、酶切 、连接 、转化等多种基 因工程技术 ，经多步亚克隆后 完成能同时表达 p27和 EGFP基 因的神经元特异性表达载体 pNSE-IRES2-EGFP-p27；转染体外培养的神经元观察 EG- FP的表达及通过免疫荧光细胞化学技术观察 p27的表达。结果：经酶切和测序鉴定 。成功构建真核表达载体 pNSE— IRES2一EGFP-p27；转染 pNSE-IRES2-EGFP-p27后神经元中可见EGFP的表达，且 EGFP阳性细胞中p27表达水平明显 增高。结论 ：NSE启动子能启动 目的基 因p27和 EGFP在神经元 的表达 ，连于Flag-p27的下游 EGFP可作为报告基 因， 指示 p27的表达情况 。带启动子 NSE的Flag—p27和 EGFP双顺反子真核表达载体 的构建为进一步研究神经元细胞周 期与神经系统疾病 的关系 。并为寻找神经系统疾病 的有效基因治疗途径奠定基础 。 【关键词】 启动子 ；构建 ；靶 向性 ；真核表达载体 【中图分类号】 R49；R741 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001—2001(2007)06—0382-04 Construction and Identification ofaNSE。P‘romoterRegulatoryEukaryoticBicistronicExpression VectorPNSE ‘I‘RES2I。EGFP- p27 ZHUZhou，CHEN Hua—xian，XUYi，eta1．DepartmentofNeurology。TongjiHospital，TongjiMedic“(’ol— lege，HuazhongUniversityofS(ienceandTechnology，Wuhan430030。China [Abstract] Objective：T0constructFlag—p27andEGFPco-expressedpNSE—IRES2一EGFP—p27plasmid，andtOde— tectitsexpression incultivatedneurons．M ethods：Bywayofgeneticengineeringtechniquesasplasmidextraction，agar— osegele1ectrophoresis，restrictionenzymolysis，connection，transformationofcompetentcells，therecombinantplasmid ofpNSE-IRES2一EGFP-p27wasobtained．Theconstructedplasmidsweretransfectedtocultivatedneuronswith liposome andtheexpressionofEGFP and p27wasdetectedby immunocytochemistry．Results：pNSE—IRES2一EGFP—p27wasSUC— cessfullyconstructedandverifiedby enzymolysisandsequencing．Confocalmicroscopy revealedthataftertheplasmids