PAM14的细胞转染表达和定位.pdfVIP

维普资讯 · 638。 安徽 医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2007Dec；42(6) PAM14的细胞转染表达和定位 张庆慧，汪云飞，朱恒锐，刘晓颖，范礼斌 摘要 目的 构建带GFP标签的PAM14表达载体，将其转 细胞系本实验室保存 。 染至HEK293T细胞检测其表达 ，转染至 COS7细胞观察 1．2 主要试剂 Taq酶为TaKaRa产品；各种限制 PAM14蛋白在细胞 内的定位。方法 以含人 PAM14全长 性内切酶、T4DNA连接 酶、小牛肠碱性磷酸酶， cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板，用 PCR方法扩增 DNAMarker及蛋 白Mraker均为 Fermentas公司产 PAM14全长序列，然后插入带 GFP标签的载体pCDGFP中 品；胶回收(小量)试剂盒购 自北京道普生物科技有 构建表达载体 pCDGFP—PAM14，将构建的质粒转染至 HEK 限公司；质粒大量抽提纯化试剂盒购 自Qiagen公 293T细胞 ，提取总蛋 白，进 行 Western-blot检测 ；转染至 COS7细胞，在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果 成功 司；DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清购 自杭州 构建了表达载体pCDGFP-PAM14，此表达载体在 HEK293T 四季青生物工程材料有限公司；GFP一抗购 自Santa 细胞中能够有效表达 ，转染表明PAM14在COS7细胞主要在 Cruz公司；ECL显色试剂盒是Pierce公司产品；引物 核内表达，胞质内也有少量表达。结论 实验结果为进一步 为上海生工生物工程技术有限公司合成。其他试剂 了解PAM14的功能提供了一定的基础。 为国产分析纯或符合实验要求。 主题词 基因表达；转染；印迹法 ，蛋白质 1．3 方法 自由词 PAM14；细胞定位 1．3．1 载体构建 以含人PAM14全长 cDNA序列 中图分类号 R341；R394．2 的质粒 pACT2一PAM14为模板，PCR扩增 PAM14基 文献标识码 A 文章编号 1000—1492(2007)06—0638—04 因片段(正向引物 ：5一CGGGATCCCGCCACCArG CGGCCCCrGGAC一3；反向引物 ：5一GGAArI-ICCG PAM14(proteinassociatedwithMRG，14ku)是 一 ACGACTCGCTCT一3)，回收 PCR产物并用 BamH 种与MRG基因家族和Rb蛋 白相关的蛋 白¨-2]。 I和 EcoRI双酶切 ，再次回收酶切片段，与 BamH PAM14基因全长 cDNA序列共 381个碱基对，编码 I和EcoRI双酶切后的pCDGFP载体在 16℃下用 含 127个氨基酸残基的PAM14蛋白，具有高度的保 T4DNA连接酶连接过夜。次 日将适量的连接产物 守性，其蛋 白质结构 中含有一个卷 曲螺旋结构 转化，挑取阳性克隆后摇菌，碱裂解法小量抽提质 域…。研究显示 PAM14能与 MORF4／M