聚乙烯亚胺对肝细胞系Chang+liver、肾细胞系MDCK亚细胞毒性初步研究.pdfVIP

聚乙烯亚胺对肝细胞系Chang liver、肾细胞系MDCK 亚细 胞毒性的初步研究 1 1 高小玲 姚磊 陈红专 （上海交通大学医学院药理教研室，上海，200025 ） 摘要：目的研究阳离子型聚合物聚乙烯亚胺（PEI ）对正常肝细胞系Chang liver、 正常肾细胞系MDCK 的细胞毒性，特别是对细胞膜、线粒体、溶酶体、细胞核 等亚细胞结构的毒性效应及其毒性机制。方法 采用高内涵分析、流式细胞分析、 激光共聚焦成像分析和Wesrern Blot 等技术。结果 高内涵分析显示PEI 可浓度 依赖性地引起细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、溶酶体酸性环境破坏、细 胞核固缩等毒性效应，其中细胞膜通透性、溶酶体毒性为可逆性变化，线粒体膜 电位下降在恢复24 h 后反而更明显；流式细胞分析显示凋亡并非PEI 引起的急 性细胞毒性的主要机制；激光共聚焦显微镜成像分析和Western Blot 实验发现PEI 能明显诱导细胞自噬。结论 PEI 可引起细胞膜细胞膜通透性增加、线粒体膜电 位下降、溶酶体酸性环境破坏、细胞核固缩等多种亚细胞毒性；PEI 可诱导细胞 自噬，这可能与其细胞毒性密切相关。该研究在一定程度上深化了阳离子型聚合 物细胞毒性机制研究，揭示了PEI 引起细胞毒性的新机制，为该类载体的安全性 评价提供了新视角。 关键词：细胞毒性；自噬；细胞核；细胞膜；线粒体；溶酶体 中图分类号：R186 文献标识码：A 阳离子型聚合物由带正电荷的高分子聚合物构成，可通过静电相互作用与 DNA 形成纳米级复合物，被广泛用于基因药物递送，是目前唯一获得较高体内 基因递送效果的非病毒基因载体。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine ，PEI ）是常用 的阳离子型聚合物之一，这类聚合物载体在基因和某些化学药物的递送上显示了 [1-3] 其他载体难以比拟的优势，但其临床应用却存在一大障碍——细胞毒性较大 。 肝、肾分别是体内最重要的代谢和排泄器官，也是阳离子型聚合物体内主要分布 [4-6] 器官 ，因此肝、肾毒性可能成为其体内应用的主要障碍。现有的PEI 细胞毒 性评价往往采用反映细胞某方面功能的单一指标，缺乏对亚细胞结构与功能全 面、综合的分析，极大限制了该类载体细胞毒性机制的阐明和安全性载体的设计。 本研究采用细胞组学的方法，通过高内涵分析、流式细胞分析、激光共聚焦成像 分析和Wesrern Blot 等技术研究了PEI 对正常肝细胞系Chang liver、正常肾细胞 系MDCK 的细胞毒性，特别是对细胞膜、线粒体、溶酶体、细胞核等亚细胞结 构的毒性效应，旨在进一步揭示PEI 的细胞毒性机制，为该类载体的安全性评价 提供了新视角，也为安全性载体的设计和评价提供有价值的参考。 1 材料与仪器 1.1 细胞系:肝细胞系changliver ；肾细胞系MDCK 1.2 主要药品与试剂:聚乙烯亚胺（PEI ）（Branched, 25 K, Sigma ）；高糖DMEM （Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ，HyClone ）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS, GIBCO ）；0.25% 胰蛋白酶-EDTA （GIBCO ）；青霉素– 链霉素 (penicillin/streptomycin, GIBCO)；非必需氨基酸（GIBCO ）；L-谷氨酰胺（GIBCO ）； 十二烷基硫酸钠（SDS ）(Sigma) ；电泳级四甲基乙二胺（TEMED ）（Merck ）； PVDF 膜（Millipore ）。 1.3 主要仪器：二氧化碳培养箱（THERMO ）；高内涵筛选分析仪（THERMO ）； 激光共聚焦显微镜（LSCM510 ，ZEISS ）；流式细胞仪（FACSCalibur ，BECTON DICKINSON ）；蛋白电泳槽（BIO-RAD ）。 2 实验方法 2.1 细胞培养 细胞培养液（90% DMEM，10% FBS，1% 青霉素–链霉素，1% 非必需氨 基酸，1% L-谷氨酰胺