基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程中应用.pdfVIP

基因敲除策略在氨基酸产生菌 代谢工程中的应用2 黄钦耿2 施巧琴1，2 吴松刚1，2 1工业微生物发酵技术国家工程研究中心{福建师范大学}福州 2福建麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福州 [摘要]基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术，在工业微生物代谢工程中具有广 泛应用。从基因敲除技术的一般程序出发，主要介绍了工业微生物常用的基因敲除系统， 重点总结了基因敲除策略在微生物代谢工程中的应用，展望了代谢工程的发展前沿和应用 前景. [关键词]基因敲除；同源重组；代谢工程 近年来由于基因组学、应用分子生物学与分析技术的发展，越来越多的研 究方法和策略被应用于代谢工程的研究，基因敲除技术便是其中重要的一种。 基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术。是通过同源 重组将签蘧基固定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰 改造染鱼佳上某一基因的一种技术。利用微生物体内的同源重组系统，在一定 选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生 同源重组，从而改变细胞的遗传特性。它克服了随机整合的盲目性和偶然性， 是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子 生物学技术上继藿薹国撞苤后的又一革命。尤其是条件性、透昱丝基国扛塑系 统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可 靠，它的发展为氨基酸代谢工程提供了一个全新的、强有力的研究策略． 1基因敲除技术的原理及一般程序 基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因缺失或失活的技术．通常意 义上的基因敲除主要的原理是基因的同源重组机制，是指用外源的基因片段与 受体细胞的基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而替代靶基因片 段，达到目的基因失活或缺失的目的．这种技术的优点在于能够对特定位点的 基因序列进行精准操作．在微生物方面的研究主要集中于基因功能和基因工程 育种的研究方面。虽然各种敲除的系统有不同，但基因相同的原理，基因敲除 也有着一般的相同程序，主要包括： (1)PCR引物的设计．根据所需要敲除的 目标基因的侧翼序列或起止序列以及特异性的筛选标记(如氯霉素抗性标记等) 序列设计特异性的敲除组件的扩增引物(可根据敲除体系的需要设计侧翼同源 序列的长度，也可设计侧翼序列的上下游序列获得长同源序列的敲除组件)， 同时为方便后期的筛选需设计多对的中间验证引物。(2)敲除组件的PCR扩增 及敲除载体的构建．采用两轮次的PCR进行侧翼同源序列及重叠序列和筛选标记 序列等敲除组件的线性扩增；拟或利用重叠的序列粘端构建环状质粒载体实现 目标基因重组交换． (3)敲除组件导入受体细胞。在微生物系统中，一般采用 电穿孔的方式将线性敲除组件或环状的敲除载体，但具体的电穿孔的条件根据 不同的细胞而定。 (4)同源重组的筛选与鉴定。由于在微生物中发生同源重组 的频率比较低，因此同源重组的筛选和检测是基因敲除技术所要解决的关键问 题。载体本身或线性组件所携带的抗性筛选标记是筛选的标准之一，同时可以 通过PCR进行进一步的筛选鉴定，经PCR筛查到的候选转化子必须经过Southern 分析确证，最终确定是否是已经替换或缺失的阳性细胞。另外，对于敲除的目 的基因可以引起形态变化的细胞，形态的观察和记录是确定基因缺失或替换的 重要佐证． 2微生物的基因敲除系统 据同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的敲除组件的类型(如单 链／双链、线彬环状)、重要的参与同源重组的功能蛋白(RecA酶、RecBCD酶 等及噬菌体中具有相似功能的酶)以及功能位点(Chi位点)等进行分子设计， 即可衍生出各种不同的基因敲除方法。如在大肠杆菌中，基因的替换敲除系统 i特异位点的重组策 有：RecBCD-sacB重组系统、RecA依赖的重组敲除体系、Ch 略等；在酵母中常用的进行基因敲除的策略主要有两种，一是基于PCR介导的基 因删除系统，二是转座子标记的突变系统；噬菌体的重组系统包括RecET系统和 Red重组系统以及噬菌体退火蛋白介导的短链基因介导系统；其他微生物中的基 因敲除策略主要有转座子突变系统及自杀质粒介导的基因缺失策略。下面以大 肠杆菌的Red系统介导的基因敲除和真核酵母的基因敲除方法为例，介绍同源重 组原理的基因敲除的一般策略． 2．1Red系统介导的大