杆菌肽印迹聚合物在高效液相色谱与应用.pdfVIP

第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 P．B056 杆菌肽印迹聚合物在高效液相色谱中的应用 康宁a，耿利娜a，孙立权a，武利庆6，罗爱芹矿+ (8北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081)； (b中国计量科学院，北京100013) 分子印迹聚合物(MolecularlyImprintedPolymer，MIP)是一种人工合成的新型功能高分子材料， 它对合成它的模板分子具有特异的识别性能。分子印迹聚合物已经广泛应用在色谱分析分离、固相 萃取、膜分离、生物传感器、模拟酶等方面，但很多应用还只局限于小分子物质，多肽等生物大分 子成功应用的报道较少。杆菌肽是整肠生菌生产的多肽抗生素，常被用于饲料添加剂，但目前欧盟 已禁止其作为饲料添加剂使用，如果将杆菌肽印迹聚合物作为高效液相色谱及固相萃取等的固定相， 可能会对微量或痕量杆菌肽的检测具有重要意义。 本文以杆菌肽印迹聚合物作为高效液相色谱的固定相，成功实现了杆菌肽和其类似物短杆菌肽 的分离。 关键词：分子印迹，杆菌肽，高效液相色谱 1 实验部分 1．1试剂与仪器 试剂：4．乙烯基吡啶(4．Vpy，青岛润仓化工有限公司)，乙二醇二甲基丙烯酸脂(EDMA，沙多玛公 h后 司)，偶氮二异丁腈(AIBN，上海市四赫维化工有限公司，使用前经95％乙醇重结晶并真空干燥24 备用)，杆菌肽(Sigma-Aldrich)，短杆菌肽(中国计量科学院) 996 仪器：Waters高效液相色谱仪系统：Waters515二元梯度泵、Waters717自动进样器、Waters Millennium 光电二极管阵列检测器、Waters (Alltech仪器公司)；空气泵(北分瑞利有限公司)等。 1．2聚合物合成 在5mL甲醇中加入50mg乙酸锌，充分溶解后加入71mg杆菌肽及106mg4-Vpy，充分振荡使 其形成络合物，最后加入3mL 中，真空熔封，60℃水浴中聚合24h。聚合物经粉碎后用甲醇．乙酸溶液(体积比7：3)索氏提取24h， 研磨后过300目筛，再以丙酮沉降除去较细颗粒。非印迹聚合物(NIP)除不加模板外其余合成方法相 同。 1．3聚合物的吸附实验 将O．19聚合物加入250mMZnAc2的甲醇溶液中振荡吸附8h，聚合物用甲醇清洗后加入 定吸光度值，计算吸附量Q。短杆菌肽和L．酪氨酸环二肽的测定方法相同。 Q=(Co—C)V／，m，其中Co为初始浓度，C为吸附平衡浓度，V为溶液体积，m为聚合物质量。 1．4高效液相色谱分离多肽混合物 利用湿法装柱，以甲醇．异丙醇(体积比1：1)为匀浆剂，甲醇为顶替剂，色谱柱为不锈钢色谱 mm×4．6 ZnCl2的甲醇溶液负载金属离子后，使用甲醇冲至基线 柱000 mm)。色谱柱用150mL20mM 平衡。分离杆菌肽和短杆菌肽混合物的流动相为20mM mL·min一，未 ZnAc2的甲醇溶液，流速为0．3 负载金属离子的色谱柱以甲醇作为流动相。 2结果与讨论 ． 2．1吸附结果 通过聚合物对杆菌肽和不同分子量多肽的吸附结果可以看到，印迹聚合物对其它多肽的吸附量 都小于其对模板分子的吸附量，印迹聚合物对杆菌肽的吸附量也大于空白聚合物的吸附量。而对于 短杆菌肽的吸附结果正相反，空白聚合物吸附量与印迹聚合物的吸附量相差不大。正是由于形成了 与模板分子相契合的印迹空穴，从而只对形状与印迹空穴相契合的模板分子进行识别。 1 ”通讯联系人，罗爱芹，Email：cloud21 1@163．com；Tel：+8610