实验四 PCR基因扩增.ppt

实验四 PCR基因扩增 实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 PCR技术的原理 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 实验仪器 实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物 7、吸头、50ul PCR管 试剂 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4×dNTP (每种1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板 引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul 实验步骤 1在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系： PCR反应程序 (1) 94℃变性5min， (2) 94℃变性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)30次 （6）72 ℃延伸1min。 实验报告 要求： 1、写出本实验目的、原理； 2、实验器材及实验步骤； 3、列出实验结果示意图并分析原因。 实验结果 * * (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 一般PCR反应条件 电泳仪 琼脂糖凝胶电泳槽 PCR仪 凝胶成像系统 移液器 ? CK(ul) 1#(ul) 模板 0 1 引物1 0.4 0.4 引物2 0.4 0.4 10× PCR Buffer 2 2 Taq酶 0.5 0.5 dNTPs 0.4 0.4 ddH2O 14.3 15.3 Total 20 20 * Parameter Concentration Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume 10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μM(each one) 100 g/ml (optional) 0.5 μM(each one);(0.1—1.0μM) 0.5mM 10mM unit 25—100μl